實驗植物DNA提取及檢測

植物總DNA的提取

及瓊脂糖凝膠電泳檢測當(dāng)前第1頁\共有30頁\編于星期二\6點植物基因組DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測當(dāng)前第2頁\共有30頁\編于星期二\6點一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)提取和純化高等植物總DNA的方法，理解其原理。當(dāng)前第3頁\共有30頁\編于星期二\6點脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來使核蛋白釋放出來。植物總DNA包括細(xì)胞核DNA和細(xì)胞核外DNA,前者存在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。二、實驗原理當(dāng)前第4頁\共有30頁\編于星期二\6點當(dāng)前第5頁\共有30頁\編于星期二\6點細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸基本過程當(dāng)前第6頁\共有30頁\編于星期二\6點①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。

細(xì)胞破碎

當(dāng)前第7頁\共有30頁\編于星期二\6點SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價鍵。CTAB法CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA提取當(dāng)前第8頁\共有30頁\編于星期二\6點蛋白質(zhì)

常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。RNA常選用RNase消化，或是用LiCl來消除大分子的RNA。酚類物質(zhì)

提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。DNA純化（去雜質(zhì)）當(dāng)前第9頁\共有30頁\編于星期二\6點實驗材料植物葉片(去葉脈)試劑2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、Nacl）TE緩沖液(pH=8.0)氯仿：異戊醇(24:1)巰基乙醇異丙醇70%乙醇

三、材料與試劑當(dāng)前第10頁\共有30頁\編于星期二\6點①離心機(jī)②水浴鍋③研缽④微量移液器儀器用具當(dāng)前第11頁\共有30頁\編于星期二\6點移液器－量程的選擇當(dāng)前第12頁\共有30頁\編于星期二\6點1．取2g清洗涼干的植物幼嫩葉片于研缽中，加入液氮，迅速研磨。將2×CTAB抽提液與2ml巰基乙醇在提取前混合后于65℃水浴中加熱30分鐘。2．將0.5mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入1mlCTAB提取液，置于65℃水浴中保溫30min，其間顛倒混勻2－3次。破碎細(xì)胞3.加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻20分鐘，防止成團(tuán)。8000r/min，離心5min，取上清。抽提去蛋白4．將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加等體積異丙醇（預(yù)冷）。顛倒混勻，可見DNA絮狀沉淀。沉淀核酸5．8000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。

將沉淀回溶于無菌水或TE緩沖液待測。四、操作步驟當(dāng)前第13頁\共有30頁\編于星期二\6點1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與CTAB抽提液充分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（2－5％），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集CTAB與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。五、注意事項當(dāng)前第14頁\共有30頁\編于星期二\6點六、作業(yè)為了獲得高質(zhì)量的植物總DNA，在分離提取過程中應(yīng)注意那些問題？當(dāng)前第15頁\共有30頁\編于星期二\6點瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。當(dāng)前第16頁\共有30頁\編于星期二\6點DNA分子在高于等電點的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。在一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。二、實驗原理當(dāng)前第17頁\共有30頁\編于星期二\6點瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2當(dāng)前第18頁\共有30頁\編于星期二\6點三、實驗儀器和試劑儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等當(dāng)前第19頁\共有30頁\編于星期二\6點Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液當(dāng)前第20頁\共有30頁\編于星期二\6點電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。

作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液當(dāng)前第21頁\共有30頁\編于星期二\6點溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。GoldViewTM:

是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時，GoldViewTM與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈紅色熒光。GoldView不僅能染DNA，也可用于染RNA。

核酸染色劑當(dāng)前第22頁\共有30頁\編于星期二\6點DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)前第23頁\共有30頁\編于星期二\6點不同種類DNAMarker當(dāng)前第24頁\共有30頁\編于星期二\6點1.凝膠制備

制備1%瓊脂糖凝膠。稱取0.8g瓊脂糖加入80mL1×TAE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60℃時，加入EB或GoldViewTM

10ul。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。2.加樣

取15μlDNA樣液與2μl上樣buffeer混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。3.電泳

接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為1~5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）,待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。4.觀察拍照四、