級碩士生HPLC高效液相色譜培訓(xùn)(司興奎)

高效液相色譜儀及其應(yīng)用InstrumentsandApplicationofHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)

司興奎教授/博士2015-12-31當前第1頁\共有146頁\編于星期三\10點一、概述

二、高效液相色譜儀

三、HPLC分離類型

四、HPLC固定相和流動相

五、影響HPLC分離因素與條件選擇主要授課內(nèi)容當前第2頁\共有146頁\編于星期三\10點

1.1色譜法起源石油醚碳酸鈣顆粒色素混合物分離組分1903年由俄國植物學(xué)家茨維特分離植物色素時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法（chromatography）。1概述當前第3頁\共有146頁\編于星期三\10點流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體，可以是液體，也可以是氣體。固定相：填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相，可以是固體，也可以是液體。色譜柱：裝有固定相的玻璃管或不銹鋼管。色譜法：又稱層析法，是根據(jù)利用樣品中不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的樣品混合物進行洗脫，不同物質(zhì)以不同速度沿固定相移動，最終達到分離的效果的一種分離和分析方法。

1.2色譜法定義不同相態(tài)包括：氣-固，GS；氣-液，GL；

液-固，LS；液-液，LL。當前第4頁\共有146頁\編于星期三\10點

1.3色譜法分類液相色譜（以流動相）

LiquidChromatography(LC)-LSC/LLC高效液相色譜（以流動相）

HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)氣相色譜（以流動相）

GasChromatography(GC)-GSC/GLC薄層色譜（以固定相）

Thin-LayerChromatography(TLC)毛細管電泳

CapillaryElectrophoresis(CE)當前第5頁\共有146頁\編于星期三\10點液相色譜分離系統(tǒng)由固定相和流動相組成；固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑（或洗脫液）；被分離混合物（溶質(zhì)）由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。

1.4液相色譜法原理當前第6頁\共有146頁\編于星期三\10點柱層析分離法的有關(guān)裝置當前第7頁\共有146頁\編于星期三\10點實驗室柱層析裝置當前第8頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第9頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第10頁\共有146頁\編于星期三\10點高效液相色譜法原理與液相色譜法原理相同，但其效率更高，故此得名；在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器等技術(shù)設(shè)備，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。

1.5高效液相色譜法原理當前第11頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第12頁\共有146頁\編于星期三\10點經(jīng)典LC是重力加料，流出速度極慢，常需要10-20h；HPLC由于配備了高壓輸液設(shè)備，流速高，只要數(shù)分鐘或幾十分鐘即可完成分離和分析過程。對氨基酸分離，用經(jīng)典LC法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用HPLC，lh內(nèi)即可完成。HPLC已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)分離和分析。HPLC優(yōu)點：高速、高效、高靈敏度、高自動化。HPLC缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格。

1.6高效液相色譜法的應(yīng)用及優(yōu)缺點當前第13頁\共有146頁\編于星期三\10點2高效液相色譜儀當前第14頁\共有146頁\編于星期三\10點液相色譜簡易流程圖輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理當前第15頁\共有146頁\編于星期三\10點2.1流程（processofHPLC）首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

當前第16頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第17頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2主要部件（mainassemblyofHPLC）

4/6個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)；

脫氣裝置；梯度洗脫；進樣系統(tǒng)；分離系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)；

此外還配有自動進樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。當前第18頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第19頁\共有146頁\編于星期三\10點

2.2.1高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。高壓輸液泵核心部件。壓力：150～350×105Pa。應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。當前第20頁\共有146頁\編于星期三\10點常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。

恒流泵特點：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；

恒壓泵特點：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機械往復(fù)泵。當前第21頁\共有146頁\編于星期三\10點輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見下表。名稱恒流或恒壓脈沖更換流動相梯度洗脫再循環(huán)價格

氣動放大泵恒壓無不方便需兩臺泵不可高螺旋傳動注射泵恒流無不方便需兩臺泵不可中等單活塞往復(fù)泵恒流有方便可可較低雙活塞往復(fù)泵恒流小方便可可高隔膜往復(fù)泵恒流有方便可可中等輸液泵種類及工作原理當前第22頁\共有146頁\編于星期三\10點（動畫）當前第23頁\共有146頁\編于星期三\10點雙活塞往復(fù)泵的輸液流量比單活塞泵小得多。

優(yōu)點：

不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗。缺點：設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。雙活塞往復(fù)泵的構(gòu)造和排液特性當前第24頁\共有146頁\編于星期三\10點（動畫）

優(yōu)點：隔膜泵活塞不直接與流動相接觸，故不存在活塞密封墊磨損對流動相的污染。隔膜泵死體積小（約0.1mL），因此，更換流動相后平衡快，利于梯度洗脫。

缺點：結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，價格較貴，和單活塞機械往復(fù)泵一樣，也產(chǎn)生脈沖，也需要配置阻尼裝置來消除脈沖。當前第25頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2.2脫氣裝置流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進入色譜柱,排出這些氣泡則很費時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。當前第26頁\共有146頁\編于星期三\10點目前，液相色譜流動相脫氣使用較多的是：①離線超聲波振蕩脫氣；②在線惰性氣體（氦氣）鼓泡吹掃脫氣；③在線真空脫氣。真空脫氣裝置：將流動相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮氣、單流路真空脫氣裝置的原理二氧化碳就會從膜內(nèi)進入膜外而被脫除。一般真空脫氣裝置有多條流路，可同時對多個溶液進行脫氣。當前第27頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2.3梯度洗脫裝置當前第28頁\共有146頁\編于星期三\10點保留值：液相操作中，當儀器的操作條件保持不變時，任一物質(zhì)的色譜峰總是在色譜圖上固定的位置出現(xiàn)，即有一定的保留值。又包含：死時間，保留時間，校下保留時間，保留體積，等等。分離及分析難點：在進行多成分的復(fù)雜樣品的分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。梯度洗脫：HPLC的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。①線性梯度;②階梯梯度高壓梯度低壓梯度當前第29頁\共有146頁\編于星期三\10點梯度洗脫裝置：·高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入·低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。HPGE梯度混合器低壓梯度比例閥LPGE高壓常壓常壓高壓高壓/低壓梯度系統(tǒng)當前第30頁\共有146頁\編于星期三\10點高壓梯度裝置結(jié)構(gòu)優(yōu)點：只要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實現(xiàn)自動化控制。缺點：使用了兩臺高壓輸液泵，使儀器價格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實現(xiàn)二元梯度操作。當前第31頁\共有146頁\編于星期三\10點四元低壓梯度系統(tǒng)結(jié)構(gòu)只需一個高壓泵，混合就在泵前安裝了一個比例閥中完成。因比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合易形成氣泡，常配置在線脫氣裝置，來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后進入比例閥，混合后從一根輸出管進入泵體。當前第32頁\共有146頁\編于星期三\10點梯度洗脫裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。當前第33頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2.4進樣系統(tǒng)

HPLC柱比GC柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。

柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此HPLC法中對進樣技術(shù)要求較嚴。流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置。

結(jié)構(gòu)如圖所示：當前第34頁\共有146頁\編于星期三\10點手動進樣器的原理圖load位置inject位置柱泵泵柱定量環(huán)２３１ ４６５１２３５４６當前第35頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第36頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2.5分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。當前第37頁\共有146頁\編于星期三\10點

柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。

一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。當前第38頁\共有146頁\編于星期三\10點2.2.6檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。當前第39頁\共有146頁\編于星期三\10點

（l）紫外檢測器（ultravioletdetector）

應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。其特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池很小（1mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。當前第40頁\共有146頁\編于星期三\10點

UV/Visdetecter當前第41頁\共有146頁\編于星期三\10點樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處得到一吸光度值(2)光電二極管陣列檢測器(photodiodearraydetector)當前第42頁\共有146頁\編于星期三\10點Photodiodearraydetecter當前第43頁\共有146頁\編于星期三\10點光電二極管陣列檢測器

光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。當前第44頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第45頁\共有146頁\編于星期三\10點二極管陣列檢測器優(yōu)點：可實施一個樣品全波長掃描，方便快速確定最佳吸收波長?？赏瑫r給出紫外光譜和色譜圖，便于組分定性和定量。提供多種色譜峰純度判斷方法，包括：等高線圖法、光譜色譜三維圖法、重疊光譜圖法、波長比圖法和色譜峰純度計算法等。可進行峰的純度檢測。可提供各種類型的色譜圖，其中包括：單波長色譜圖、任意兩個波長的吸收比色譜圖、波長時間程序色譜圖、最大吸收波長色譜圖以及總體吸收色譜圖。其中最大吸收波長色譜圖為靈敏度最高的檢測方式，而總體吸收色譜圖為定量重復(fù)性最好的方法。當前第46頁\共有146頁\編于星期三\10點(3)示差折光率檢測器(differentialrefractiveindexdetector)除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達10-7g·cm-3。

主要缺點：對溫度變化敏感，靈敏度低、并且不能用于梯度淋洗。

分類：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；當前第47頁\共有146頁\編于星期三\10點示差折光檢測器當前第48頁\共有146頁\編于星期三\10點（4）熒光檢測器(fluorescencedetector)

特點：

高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。當前第49頁\共有146頁\編于星期三\10點熒光檢測器原理當前第50頁\共有146頁\編于星期三\10點（5）電導(dǎo)檢測器(conductometricdetector)測量溶劑電導(dǎo)率，特別適合于離子溶液。（6）電化學(xué)檢測器(electrochemicaldetector)

當前第51頁\共有146頁\編于星期三\10點（7）電流檢測器(amperometricdetector)（8）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）

evaporativelightscatteringdetector

由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。當前第52頁\共有146頁\編于星期三\10點蒸發(fā)光散射檢測器原理當前第53頁\共有146頁\編于星期三\10點

色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮氣）霧化成微細液滴，液滴通過加熱漂移管時，流動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號。因為散射光強只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。當前第54頁\共有146頁\編于星期三\10點。。檢測器檢測下限/(g/mL)線性范圍選擇性梯度淋洗主要特點UV-Vis10-10103～104有可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很小；對溶質(zhì)的響應(yīng)變化大。熒光10-12～10-11103有可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響電化學(xué)10-10103有困難選擇性高；易受流動相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。蒸發(fā)光散射10-9無可可檢測所有物質(zhì)。示差折光10-1104無不可可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感。質(zhì)譜10-10無可主要用于定性和半定量。常用檢測器的檢測范圍及特點當前第55頁\共有146頁\編于星期三\10點3.1液-固吸附色譜法(liquid-solidadsorptionchromatography,LSAC)液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。3HPLC分離類型固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。當前第56頁\共有146頁\編于星期三\10點3.1.1固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。在HPLC中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。當前第57頁\共有146頁\編于星期三\10點

固體相和溶質(zhì)間的相互作用力是什么?強OHOHC18(ODS)弱疏水性、親脂性、非極性親水性、極性？Si

物理作用來自于硅膠表表面與溶質(zhì)分子之間的范德華力，化學(xué)作用主要是硅膠表面的硅羥基與待分離物質(zhì)之間的氫鍵作用。當前第58頁\共有146頁\編于星期三\10點疏水性：指的是一個分子（疏水物）與水互相排斥的物理性質(zhì)。疏水性分子包含有烷烴、油、脂肪和多數(shù)含有油脂的物質(zhì)。大多數(shù)的疏水物通常也是親脂性的。疏水性分子偏向于非極性，并因此較會溶解在中性和非極性溶液（如有機溶劑）。疏水性分子在水里通常會聚成一團，而水在疏水性溶液的表面時則會形成一個很大的接觸角而成水滴狀。親脂性是指一個化合物融解在脂肪、油、脂質(zhì)或非極性溶劑的能力。這些非極性溶劑本身就親脂，因此親脂性的物質(zhì)就會溶在親脂的溶劑，親水性的物質(zhì)就會溶于親水性的溶劑內(nèi)。一定條件下，親脂性、疏水性和非極性可以互換。

疏水性（hydrophobicity）當前第59頁\共有146頁\編于星期三\10點疏水性? 如果樣品有–CH3CH2CH2---:碳鏈–:芳香基? 如果樣品有-COOH-NH2-OH:羧基:氨基:羥基作用力強作用力弱極性指一個共價鍵或一個共價分子中電荷分布的不均勻性。如果電荷分布得不均勻，則稱該鍵或分子為極性；如果均勻，則稱為非極性。溶劑中水極性最大，石油醚極性最小。當前第60頁\共有146頁\編于星期三\10點

固定相極性變化對分離的影響C18(ODS)強樣品SiC8Si一般樣品弱樣品C3ODS十八烷基硅烷

OctadecylsilylTMS三甲基硅烷

Trimethylsilyl極性分子易溶于極性溶劑，非極性分子易溶于非極性溶劑，即“相似相溶”。氨等極性分子和氯化鈉等離子化合物易溶于極性的水。CO2及具有長碳鏈的有機物如油脂多不溶于水，而溶于非極性的有機溶劑，如石油醚。Si親水性（hydrophilicity）：指分子帶有極性基團的分子，對水（極性分子）有大的親和能力，可以吸引水分子，或溶解于水的特性。當前第61頁\共有146頁\編于星期三\10點水(最大）>甲酰胺>三氟乙酸>DMSO（Dimethylsulfoxide，二甲基亞砜）>乙腈>DMF（DimethylFum-arate，即富馬酸二甲酯）>六甲基磷酰胺>甲醇>乙醇>乙酸>異丙醇>吡啶>四甲基乙二胺>丙酮>三乙胺>正丁醇>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲酸甲酯>三丁胺>甲乙酮>氯仿>乙酸乙酯>三辛胺>碳酸二甲酯>乙醚>異丙醚>正丁醚>三氯乙烯>二苯醚>二氯甲烷>二氯乙烷>苯>甲苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油（石油醚）(最小)常用39種溶劑的極性順序當前第62頁\共有146頁\編于星期三\10點分析條件柱:Shim-packCLC-ODS流動相:MeOH:H2O=7:3流速:1.0mL/min溫度:40C進樣體積:10uL檢測器:UV-254nm峰1.苯甲酸甲脂2.苯甲酸乙脂3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯ODS C8 TMS固定相極性變化對分離的影響當前第63頁\共有146頁\編于星期三\10點3.1.2流動相

一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中：對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。下表列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。當前第64頁\共有146頁\編于星期三\10點溶劑ε0溶劑ε0溶劑ε0氟烷-0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82環(huán)己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95常用溶劑在氧化鋁吸附劑中溶劑強度參數(shù)（ε0）

ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁當前第65頁\共有146頁\編于星期三\10點

在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體（互不相溶）。它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。3.2.1分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。3.2液一液分配色譜法（LLPC）

liquid-liquidpartitionchromatography當前第66頁\共有146頁\編于星期三\10點萃?。阂喾Q抽提，是利用系統(tǒng)中組分在溶劑中有不同的溶解度來分離混合物的單元操作。如質(zhì)粒提取（萃取）中，利用蛋白質(zhì)和脂類在兩種互不相溶（或微溶）的溶劑，即水和苯酚和氯仿中溶解度或分配系數(shù)的不同，將水相中的蛋白及脂類轉(zhuǎn)移到另外苯酚和氯仿中的方法。

固定相

由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′-氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取．斍暗?7頁\共有146頁\編于星期三\10點

色譜柱內(nèi)的填充吸附劑是多孔的惰性固體，用非揮發(fā)性的惰性液體涂漬。被分離樣品與水和惰性液體有大小不同的溶解度。如果被吸附的物質(zhì)是液體，發(fā)生“萃取”現(xiàn)象。早期涂漬固定液到多孔惰性固體的方法，因存在固定液流失，較少采用；為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。它將各種不同有機基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。硅膠是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進行的。當前第68頁\共有146頁\編于星期三\10點在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。

正相分配色譜normalphase：采用流動相的極性小于固定相的極性，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。

反相分配色譜reversephase：采用流動相的極性大于固定相的極性。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。3.2.3流動相當前第69頁\共有146頁\編于星期三\10點正相色譜（固定相親水，流動相極性小于固定相）? 硅膠柱? 氰基柱? 氨基柱? 二醇基柱:常用:常用:分析糖:分析蛋白質(zhì)硅膠SiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)化學(xué)鍵合相當前第70頁\共有146頁\編于星期三\10點

OHHOSiOHSiOH強弱非常弱氫鍵力正相色譜固定相與樣品間相互作用力是什么?當前第71頁\共有146頁\編于星期三\10點正相色譜的氫鍵力? 如果樣品有-COOH-NH2-OH氫鍵力強.:羧基:氨基:羥基? 如果樣品沒有任何官能團，象碳水化合物? 如果樣品有大的基團,由于空間障礙氫鍵力弱.正相色譜主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。當前第72頁\共有146頁\編于星期三\10點反相色譜固定相疏水（流動相極性大于固定相）C18(ODS)強樣品SiC8Si一般樣品弱樣品C3ODS十八烷基硅烷

OctadecylsilylTMS三甲基硅烷

TrimethylsilylSi八烷基硅烷

Octadecylsilyl當前第73頁\共有146頁\編于星期三\10點反相色譜固定相與不同極性樣品結(jié)合差異? 如果樣品有–CH3CH2CH2---:碳鏈–:芳香基? 如果樣品有-COOH-NH2-OH:羧基:氨基:羥基作用力強作用力弱流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無機鹽的緩沖溶液等，主要用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物。當前第74頁\共有146頁\編于星期三\10點3.3化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

chemicalbonded

partitionchromatography

采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。

由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。當前第75頁\共有146頁\編于星期三\10點3.3.1鍵合固定相類型

用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅羥基(Si-OH)與有機物可成鍵，即可得到各種性能的固定相。一般可分三類：（1）極性鍵合固定相（極性基團，正相）

鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。當前第76頁\共有146頁\編于星期三\10點（2）非極性鍵合固定相（疏水基團，反相）

：

鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。（3）離子交換基團鍵合固定相陰離子交換的堿性基團，如：季/叔/仲/伯胺鹽；陽離子交換的酸性基團，磺酸（-SO3H）、羧酸（-COOH）等。當前第77頁\共有146頁\編于星期三\10點3.3.2鍵合固定相的制備（l）硅氧碳（≡Si-O-C）鍵合固定相它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅羥基發(fā)生酯化（硅酸酯）反應(yīng)：

≡Si-OH＋ROH→≡Si-O-R＋H20由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。（2）硅碳鍵（≡Si-C）或硅氮鍵（≡Si-N）共價鍵合固定相當前第78頁\共有146頁\編于星期三\10點≡Si-C或≡Si-N共價鍵合固定相優(yōu)缺點：共價鍵健合固定相優(yōu)點是不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，必須限制pH在4～8范圍內(nèi)。（3）硅氧硅碳（≡Si-O-Si-C）鍵合固定相這類鍵固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在70℃以下，pH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。當前第79頁\共有146頁\編于星期三\10點化學(xué)鍵合相色譜的特點：優(yōu)點：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有80％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。缺點：不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。如何根據(jù)樣品極性來選擇化學(xué)鍵合的固定相見下表。當前第80頁\共有146頁\編于星期三\10點樣品種類組合基團流動相色譜類型實例低極性溶解于烴類-C18甲醇-水反相多還芳烴乙腈-水甘油三酯、類脂、脂溶性維生素乙腈-四氫呋喃甾族化合物、氫醌中等極性可溶于醇-CN乙腈、正己烷氯仿正己烷異丙醇等正相脂溶性維生素、甾族、芳香醇、胺、類脂止痛藥芳香胺、脂、氯化農(nóng)藥、苯二甲酸-NH2中等極性可溶于醇-C18-C8-CN甲醇、水乙腈反相甾族、可溶于醇的天然物、維生素、芳香酸、黃嘌呤高極性可溶于水-C8甲醇、乙腈、水、緩沖溶液反相水溶性維生素、胺、芳醇、抗菌素、止痛藥-CN反相-C18水、甲醇、乙腈反相離子對酸、磺酸類染料、兒茶酚胺-SO3-水和緩沖液陽離子交換無機陽離子、氨基酸-NR3+磷酸緩沖液陰離子交換核苷酸、糖、無機陰離子、有機酸化學(xué)鍵合固定相的選擇當前第81頁\共有146頁\編于星期三\10點3.4離子交換色譜法（IEC）

ion-exchangechromatography

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離。

例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。

當前第82頁\共有146頁\編于星期三\10點3.4.1離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：

陽離子交換：

陰離子交換：一般形式：R-A＋B＝R-B＋A當前第83頁\共有146頁\編于星期三\10點化學(xué)平衡常數(shù)（K）：一定溫度下，對于已達平衡的反應(yīng)體系中，生成物以它的化學(xué)計量數(shù)為乘冪的濃度之積除以反應(yīng)物以它的化學(xué)計量數(shù)為乘冪的濃度之積是個常數(shù)，這個常數(shù)叫做該反應(yīng)的化學(xué)平衡常數(shù)。K=[C]c.[D]d/([A]a.[B]b)可逆反應(yīng)aA+bBcC+dD化學(xué)平衡常數(shù)及其計算方法當前第84頁\共有146頁\編于星期三\10點達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和樣品離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示樣品離子B對于A型樹脂親和力的大?。哼x擇系數(shù)（KB/A）越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。

r:rosin當前第85頁\共有146頁\編于星期三\10點

對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價離子的順序為：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+＞Zn2+＞Mg2+對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HSO4-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2PO4-＞IO3-＞CH3COO-＞F-當前第86頁\共有146頁\編于星期三\10點3.4.2固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分。類型官能團強陽離子交換劑（SCX）strongcationexchanger-SO3H弱陽離子交換劑（WCX）weakcationexchanger-CO2H強陰離子交換劑（SAX）stronganionexchanger-N+R3弱陰離子交換劑（WAX）weakanionexchanger-NH2

離子交換劑官能團及離解度差異當前第87頁\共有146頁\編于星期三\10點

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：（l）多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型離子交換樹脂

它是在直徑約對30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層。當前第88頁\共有146頁\編于星期三\10點（3）表面多孔型離子交換樹脂

它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。（4）離子交換鍵合固定相

它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。當前第89頁\共有146頁\編于星期三\10點3.4.3流動相

離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子滯留次序為：檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH-＞F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。當前第90頁\共有146頁\編于星期三\10點陽離子的滯留次序大為：Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg2+＞

Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。注意，與上述二價及一價順序完全一致。當前第91頁\共有146頁\編于星期三\10點3.5離子對色譜法（IPC）

ionpairchromatography

離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。它是離子對萃取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀70年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。3.5.1離子對色譜法原理離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。當前第92頁\共有146頁\編于星期三\10點關(guān)于離子對色譜機理，至今仍不十分明確，已提出三種機理：離子對形成機理；離子交換機理；離子相互作用機理?，F(xiàn)以離子對形成機理說明之。假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負電的人組分離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反應(yīng)式

B+親水性+A-微疏水性?A-B+疏水性

KAB

當前第93頁\共有146頁\編于星期三\10點

由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對疏水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。

B+親水性+A-微疏水性?A-B+疏水性

KAB

當前第94頁\共有146頁\編于星期三\10點

鍵合相反相離子對色譜法

離子對色譜法類型很多，根據(jù)流動相和固定相的極性可分為反相離子對和正相離子對色譜法。其中以鍵合反相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流動相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇-水或乙腈-水）。鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛.根據(jù)離子對生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)KAB可表示為：當前第95頁\共有146頁\編于星期三\10點相比率（β）：組分在流動相和固定相分配達到平衡時，分配在流動相和固定相中組分的體積比，即Vm/Vs。分配系數(shù)（K）：指一定溫度下，處于平衡狀態(tài)時，組分在固定相中的濃度和在流動相中的濃度之比。容量因子（k）：指在一定溫度和壓力下，組分在兩相(固定相和流動相)分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比，符號為小寫k，因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)或分配比。k=[A-B+].Vs÷([A-].Vm)=K.Vs/Vm=KAB.[B+].Vs/Vm=KAB.[B+]

/

β

容量因子k，隨KAB和[B+]的增大而增大。當前第96頁\共有146頁\編于星期三\10點

陰離子分離：

常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：

常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；當前第97頁\共有146頁\編于星期三\10點3.6尺寸排阻色譜法（SEC）

size-exclusionchromatography

尺寸排阻色譜法又稱空間排阻色譜法，分子排阻色譜法，凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。當前第98頁\共有146頁\編于星期三\10點尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。（2）保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。當前第99頁\共有146頁\編于星期三\10點

3.6.1分離原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖。當前第100頁\共有146頁\編于星期三\10點凝膠色譜分離過程當前第101頁\共有146頁\編于星期三\10點尺寸排阻色譜法的分類（1）凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或緩沖溶液作流動相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。（2）凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC）：以有機溶劑作流動相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測定。當前第102頁\共有146頁\編于星期三\10點3.6.3固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

當前第103頁\共有146頁\編于星期三\10點分離過程當前第104頁\共有146頁\編于星期三\10點（2）半剛性凝膠

如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠

如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。當前第105頁\共有146頁\編于星期三\10點

排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。

選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。3.6.4流動相當前第106頁\共有146頁\編于星期三\10點3.7親和色譜法（AC）

affinitychromatograph定義：利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生物活性配位體之間的特異親和力進行分離的液相色譜方法。固定相：將具有生物活性的配位體以共價鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得。生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類似物）、輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。基質(zhì)：通常為凝膠，許多無機和有機聚合物都可形成凝膠，如瓊脂糖衍生物、多孔玻璃。當前第107頁\共有146頁\編于星期三\10點分離過程：親和色譜是吸附色譜的發(fā)展，在分離過程中涉及疏水相互作用、靜電力、范德華力和立體相互作用。在鍵合了某類配體的親和色譜柱上加入含生物活性大分子的樣品，只有那些與該柱中配位體表現(xiàn)出明顯親和性的生物大分子才會被吸附，這些被吸附的生物分子只有在改變流動相（緩沖溶液）的組成時才會被洗脫。3.7.6應(yīng)用：親和色譜主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與制備。當前第108頁\共有146頁\編于星期三\10點當前第109頁\共有146頁\編于星期三\10點Affinitychromatograph當前第110頁\共有146頁\編于星期三\10點4HPLC的固定相和流動相

HPLC固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。

剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。

硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。承受壓力上限為3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。4.1液相色譜固定相（stationaryphasesofLC）當前第111頁\共有146頁\編于星期三\10點液相色譜固定相的物理結(jié)構(gòu)當前第112頁\共有146頁\編于星期三\10點4.1.1液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型固定相

它由直徑為10μm的氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體微粒凝聚而成。早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；硅膠微粒如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的LichrosorbALOXT。這類固定相由于顆粒很細（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.當前第113頁\共有146頁\編于星期三\10點（2）表面多孔型固定相（薄殼型微珠擔體）

它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，厚度為1～2μm。如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；當前第114頁\共有146頁\編于星期三\10點為聚酰胺的，如Pellion。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。即表面積小，柱容量底。

當前第115頁\共有146頁\編于星期三\10點

性能表面多孔型全多孔型平均粒度(μm)30-405-10最佳HETP(heightequivalentoftheoreticalplate)(mm)0.2-0.40.01-0.03典型柱長(cm)50-10010-30典型柱徑(mm)2-32-5壓降(Pa/cm)1.4×1051.4×106樣品容量(mg/g)0.05-0.11-5表面積(m2/g)(液固)10-15400-600鍵合相覆蓋率(%,W/W)0.5-1.55-25離子交換容量(μmol/g)10-402000-5000裝柱方式干裝法勻漿法

兩類固定相的性能比較塔板理論是色譜學(xué)的基礎(chǔ)理論，塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多，則其分離效果就越好。當前第116頁\共有146頁\編于星期三\10點（3）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣。c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N當前第117頁\共有146頁\編于星期三\10點化學(xué)鍵合固定相的特點：

1)傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；

2)壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；

3)選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；

4)有利于梯度洗脫；

5)存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；當前第118頁\共有146頁\編于星期三\10點液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm。離子交換色譜分離固定相（1）按結(jié)構(gòu)類別：1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為單體，表面涂約1%的離子交換樹脂。當前第119頁\共有146頁\編于星期三\10點

2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型(鍵合離子交換基團)（2）按樹脂類別：

1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）

2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）當前第120頁\共有146頁\編于星期三\10點abcde離子交換的基本過程當前第121頁\共有146頁\編于星期三\10點

H+<Na+<K+<Ag+CtNa+K+Ag+前一狀態(tài)洗脫淋洗曲線當前第122頁\共有146頁\編于星期三\10點陽離子交換層析過程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強度洗脫液洗高離子強度洗脫液洗加樣平衡液洗收集當前第123頁\共有146頁\編于星期三\10點水的凈化當前第124頁\共有146頁\編于星期三\10點

尺寸排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑。當前第125頁\共有146頁\編于星期三\10點

凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l當前第126頁\共有146頁\編于星期三\10點尺寸排阻色譜法（SEC）流出順序當前第127頁\共有146頁\編于星期三\10點（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。當前第128頁\共有146頁\編于星期三\10點4.2液相色譜流動相（mobilephasesofLC）流動相特性

（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。當前第129頁\共有146頁\編于星期三\10點4.2.2流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。二元或多元溶劑組合意義：采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。當前第130頁\共有146頁\編于星期三\10點4.2.3對流動相溶劑的要求是

（1）溶劑與待測樣品的相容性。溶劑對于樣品應(yīng)必須具有合適的極性和良好的選擇性。

（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。當前第131頁\共有146頁\編于星期三\10點下表列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。溶劑正己烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氫呋喃丙酮乙腈甲醇水紫外截止波長190380265210245233212230190205187

部分常用溶劑的紫外截止波長（nm）當前第132頁\共有146頁\編于星期三\10點（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～100nm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。勿選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.當前第133頁\共有146頁\編于星期三\10點4.2.4流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)