余甘子葉提取物對慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠的保護(hù)作用研究

余甘子葉提取物對慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠的保護(hù)作用研究【摘要】目的研究余甘子葉提取物是否對慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠有保護(hù)作用。方法采用氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)及煙熏的混合刺激方法建立慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠模型，采用病理組織切片及血?dú)夥治龇椒ㄓ^察余甘子葉提取物對慢性支氣管炎及肺氣腫的病理及血氧含量的影響。結(jié)果余甘子葉提取物乙酸乙酯膏部位對由LPS+煙熏引起的慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠的支氣管炎癥及肺泡病理損害有明顯保護(hù)作用，能減少支氣管壁炎癥細(xì)胞浸潤及肺大泡形成，并能提高動脈血氧含量，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于模型對照組及陽性藥物組，而接近于正常對照組。結(jié)論余甘子葉提取物cc部位具有防治慢性支氣管炎并肺氣腫的作用。

【關(guān)鍵詞】余甘子葉提取物慢性支氣管炎肺氣腫

AbstractObjectiveTostudytheeffectoftheextractfromleavesofPhyllanthusemblicaL.onchronicbronchitisandemphysemainrats,andprovideexperimentalbasisfortheexploitationoftheleavesofPhyllanthusemblicaratmodelofchronicbronchitisandemphysemawasestablishedbyintratrachealinstillationoflipopolysaccharide(LPS)twiceandexposedtocigarettesmokeccpartcouldobviouslylessentheinfictrationofinflammatorycellsandformationofemphysema,increasearterialoxygencontent,mostofobservationalindexeswerebetterthanthoseinmodelgroupandEMtreatedccparthasobviouslyprotectiveeffetonchronicbronchitisandemphysema.

KeywordsTheextractsofleavesofPhyllanthusemblicaL.；Chronicbronchitis

余甘子葉PhyllanthusemblicaL.系大戟科葉下珠屬落葉小喬木或灌木的葉，余甘子樹在我國主要分布在福建、廣東、云南、貴州、四川、海南、廣西等省區(qū)，資源豐富。余甘子具有化痰止咳、健胃消食、清熱生津、保肝解毒等功效。主治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉痛、白喉、煩熱口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血壓病、肥胖癥、高脂血癥、濕熱性水腫和尿頻等。在我國約有16個(gè)民族使用該藥，其中以漢族和藏族等尤為習(xí)用［1］。余甘子是一味重要的傳統(tǒng)民族藥，已被載入多版《中國藥典》［2］。除余甘子外，余甘子葉也具有重要的藥理作用，在廣西民間常用來治療慢性咳嗽等疾病。我們的前期研究工作已顯示余甘子葉在體內(nèi)外具有廣泛的抗菌作用，然而，余甘子葉是否對慢性支氣管炎、肺氣腫具有治療作用仍然不清楚。為此，本項(xiàng)目主要研究余甘子葉提取物對慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法1材料動物清潔級Wistar雄性大鼠，體重180～230g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK桂2003-0003。儀器設(shè)備自制立方米玻璃艙；快速血?dú)夥治鰞x，Rapidlab348,美國Bayer公司產(chǎn)品。試劑LPS，購自美國sigma公司，用PBS液配成濃度為1mg/ml溶液；甲天下牌烤煙型香煙，焦油含量15mg，煙堿含量mg，廣西卷煙總廠生產(chǎn)；無水氯化鈣，上海泗聯(lián)化工廠產(chǎn)品，批號011001；變色硅膠，青島裕寶精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，批號050917；水合氯醛；天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，批號040413；紅霉素片，g/片，河南天方藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號050411230。試藥余甘子葉提取物乙酸乙酯膏部位，余甘子葉采自廣西邕寧縣，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)教授鑒定，經(jīng)提取分離和抗菌篩選，獲得對抗菌效果較好的醋酸乙酯膏部位。2方法動物分組取60只體重180～230g的清潔級雄性Wistar大鼠，采用隨機(jī)、均衡方法設(shè)計(jì)分為6組，即正常對照組、模型組、余甘子葉cc部位高、中、低劑量組、紅霉素對照組，每組10只；造模3周后開始給藥，給藥時(shí)間為15d，每天給藥后照常煙熏。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱髡φ战M標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)5周，大鼠可自由進(jìn)食、飲水。每天放入玻璃艙內(nèi)2h，但不予煙熏。模型組，第1，14天氣管內(nèi)每次注入LPS溶液ml，每天上、下午分別在L玻璃艙內(nèi)用香煙煙熏1h。每次20支香煙，共40支/d，第1，14天除外。連續(xù)5周。玻璃艙兩端各有一小孔與外界相通，保證常壓狀態(tài)，艙內(nèi)放置無水氯化鈣及變色硅膠吸收水分和二氧化碳，大鼠可自由進(jìn)食、飲水。給藥組在造模滿3周后開始給藥。cc部位高、中、低劑量組給藥量相當(dāng)于臨床用量的30，20和10倍，濃度分別為15，10，5mg/ml，1ml/100g大鼠體重。紅霉素陽性藥物對照組給藥量為1ml/100g體重，與臨床用量相當(dāng)。標(biāo)本采集及分析實(shí)驗(yàn)滿5周后大鼠禁食不禁水12h后取標(biāo)本及檢測和分析：①動脈血氧含量測定：從腹主動脈采集，用快速血?dú)夥治鰞x分析各組血氧含量。②支氣管肺泡液細(xì)胞計(jì)數(shù)：用10mlHanks液分2次行左支氣管肺泡灌洗，合并灌洗液后離心(2000r/min)10min，棄上清液，細(xì)胞用預(yù)冷的Hanks液洗滌3次后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。余液制成細(xì)胞片，瑞氏染色行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。③計(jì)算心臟指數(shù)：參照Fulton方法［3］，沿室間隔右緣剪下右心室，留下左心室加室間隔(LV+S)。分別稱重后，計(jì)算右心室肥大指數(shù)：RVHI=RV/(LV+S)。④肺病理組織檢查：取右肺中葉靠近肺門處，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，觀察肺組織病理改變。根據(jù)Cosio等［4］設(shè)計(jì)的小氣管病變評估方法和標(biāo)準(zhǔn)加以改進(jìn)后觀察氣管炎癥病變及評分：選取直徑≤1100μm的膜性細(xì)支氣管，觀察小氣管炎癥包括以下6項(xiàng)指標(biāo)：①上皮脫落糜爛；②上皮杯狀細(xì)胞增生；③管壁中性粒細(xì)胞浸潤；④管壁淋巴細(xì)胞浸潤，淋巴濾泡形成；⑤管壁單核巨噬細(xì)胞浸潤；⑥管腔滲出。對各組大鼠按上述6項(xiàng)指標(biāo)分別評分，無病變者為0分，將輕度、中度、重度異常分別評為1，2，3分，然后累加每一指標(biāo)的得分，將累加分占該標(biāo)本內(nèi)所被檢細(xì)支氣管可能得到的最高分的百分?jǐn)?shù)作為該標(biāo)本細(xì)支氣管這一指標(biāo)的病理積分，6項(xiàng)指標(biāo)的病理積分相加，即可得每一標(biāo)本細(xì)支氣管的病理得分。3統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果計(jì)量資料以±s表示，EXCEL軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)差異用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

右心室肥大指數(shù)計(jì)算各組大鼠右心室肥大指數(shù)無差別。結(jié)果見表1。表1各組大鼠右心室肥大指數(shù)計(jì)算結(jié)果

血?dú)夥治?/p>

模型組PaO2與正常對照組比較有顯著性差異；各給藥組PaO2與模型組比較也有顯著性差異；但各組之間PCO2無差別。結(jié)果見表2。表2各組大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果(略)

支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類模型組BALF細(xì)胞總數(shù)較正常對照組明顯升高()，其中以中性粒細(xì)胞升高為主。與模型組比較，cc部位各濃度治療組及紅霉素治療組各細(xì)胞數(shù)顯降低，但cc部位的作用與劑量未呈正相關(guān)。結(jié)果見表3。表3各組大鼠BALF有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類比較(略)

細(xì)支氣管炎癥病理評分與正常組比較，模型組細(xì)支氣管炎癥病理總分顯著增高；cc部位給藥組經(jīng)治療后病理總分顯著降低，與模型組比較有顯著差別,且療效與劑量和療程呈正相關(guān)，劑量越大，療程越長療效也越明顯。與陽性藥紅霉素治療組比較，cc部位療效更為顯著。結(jié)果見表4及圖1～6。

圖1～6可見：細(xì)支氣管炎癥改變。正常組細(xì)支氣管，管壁結(jié)構(gòu)完整，氣管上皮細(xì)胞無纖毛脫落，極少量淋巴細(xì)胞浸潤。模型組氣管管壁以淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤，局部淋巴濾泡形成，平滑肌層增生明顯，間斷斷裂，氣管上皮黏液杯狀細(xì)胞增生及鱗狀化生。cc部位組管壁結(jié)構(gòu)清晰，氣管上皮細(xì)胞少量纖毛脫落，平滑肌層結(jié)構(gòu)完整、輕度增生，無明顯黏液杯狀細(xì)胞增生，管壁炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，與紅霉素對照組相比無明顯差異。表4各組大鼠細(xì)支氣管病理指標(biāo)積分比較

平均肺泡面積通過光學(xué)顯微鏡觀測各組HE染色肺組織切片。見正常組肺泡大小均一，未見肺氣腫及肺大泡形成，肺泡間隔無水腫及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組肺氣腫明顯，肺泡擴(kuò)張，肺泡壁變薄、斷裂或消失，局部有肺大泡形成，肺泡間隔可見淤血和炎細(xì)胞浸潤。平均肺泡面積增大，與正常組比較有顯著性差異。cc部位治療組肺泡面積縮小，與模型組比較有顯著差異,且與療程與劑量成正比，療程越長，劑量越大，肺泡面積縮小越明顯，療效優(yōu)于紅霉素對照組。結(jié)果見表5及圖7～12。表5各組大鼠平均肺泡面積比較(略)

圖7～12可見肺氣腫變化。正常組肺泡大小均一，未見肺氣腫及肺大泡形成，肺泡間隔無水腫及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組各氣腔明顯擴(kuò)大，形成肺氣腫，部分肺泡間隔斷裂形成肺大泡，余肺泡間隔充血、水腫及大量炎性細(xì)胞浸潤。cc部位組氣腔輕度擴(kuò)大，形成肺氣腫，但無肺大泡形成，部分肺泡間隔水腫及炎細(xì)胞浸潤，但程度較模型組輕。

3討論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)即伴有氣流受限的肺氣腫和慢性支氣管炎，是一種重要的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)多，病死率高。吸煙是其最重要的致病因素。COPD的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)諸多趨化因子、細(xì)胞、生長因子和酶等密切相關(guān)。香煙煙霧中含有四千余種化學(xué)物質(zhì)，其中包括多種氧化劑(如氧自由基)，刺激氣管上皮細(xì)胞釋放多種趨化介質(zhì)，是削弱氣管防御屏障導(dǎo)致氣管慢性炎癥的重要原因之一。氣管炎癥又是促使包括TGF－β在內(nèi)的生長因子在肺內(nèi)高度表達(dá)的基本原因［5］。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁層結(jié)構(gòu)，它可刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等合成釋放一系列炎性介質(zhì)(如TNF-α,IL-1等)，介導(dǎo)氣管及肺組織的炎癥反應(yīng)［6］。本研究模擬這一過程，用熏煙加氣管內(nèi)注入LPS的方法，復(fù)制慢性支氣管炎肺氣腫模型。本實(shí)驗(yàn)肺組織病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)表明慢性支氣管炎、肺氣腫組大鼠氣管、支氣管管壁粘液腺及杯狀細(xì)胞增生，纖毛上皮破損、脫落，纖毛倒伏；細(xì)支氣管壁明顯增厚，伴有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡間隔變薄或斷裂，部分呼吸性細(xì)支氣管呈囊狀擴(kuò)張，部分肺泡相互融合形成肺大泡。所復(fù)制的大鼠模型符合人類慢性支氣管炎、肺氣腫的特點(diǎn)，證明模型復(fù)制成功。

許多作者［7～10］認(rèn)為，持續(xù)的肺動脈高壓是引起右心室肥大最重要，甚至是唯一的機(jī)制。缺氧引起肺血管收縮是急性肺動脈高壓主要原因。謝增柱等［11］認(rèn)為缺氧性右心室肥大發(fā)生機(jī)制是復(fù)雜的，肺動脈高壓可能起著重要作用，但不是唯一因素，紅細(xì)胞增多和非血流動力學(xué)因素也可能起一定作用。本實(shí)驗(yàn)各組大鼠右心室肥大指數(shù)無差別，說明各組大鼠均未出現(xiàn)右心室肥大?？赡艿脑蚴窃炷r(shí)間不夠長，缺氧也不嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，模型組PaO2與正常對照組比較有顯著性差異；各給藥組PaO2與模型組比較也有顯著性差異；但各組之間PCO2無差別。表明大鼠已存在肺換氣障礙，但還未出現(xiàn)殘氣量增加，至于大鼠氣流阻塞程度，應(yīng)進(jìn)一步檢測大鼠肺功能以確定。結(jié)果cc部位和紅霉素均能改善大鼠的肺換氣功能，這可能與兩藥改善肺部炎癥及肺氣腫有關(guān)。

近年來研究表明，COPD是以氣管阻塞為特征的慢性非特異性炎癥,浸潤氣管的炎性細(xì)胞主要包括CD+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，慢性支氣管炎并肺氣腫組氣管腔內(nèi)存在以中性粒細(xì)胞及單核－巨噬細(xì)胞為主的炎癥；而氣管壁以單核－巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤為主，氣管炎癥累積管壁全層(固有膜、中膜肌層和外膜),并向周圍肺組織擴(kuò)散。以上結(jié)果提示多種炎性細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞、單核－巨噬細(xì)胞在慢性支氣管炎并肺氣腫氣管炎癥發(fā)揮重要作用，提示中性粒細(xì)胞可能在炎癥的早期及炎癥的急性發(fā)作期起重要作用，而巨噬細(xì)胞可能在慢性支氣管炎并肺氣腫氣管炎癥的慢性過程中發(fā)揮更為重要的作用，巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞與一些炎癥介質(zhì)的釋放密切相關(guān)。Scheleimer等［13］認(rèn)為,肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在吞噬香煙煙霧中的顆粒物質(zhì)后能產(chǎn)生白介素-8(IL-8)等趨化介質(zhì)，氣管內(nèi)IL－8水平的增高可趨化并激活中性粒細(xì)胞。而中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放又能誘導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞IL－8基因的表達(dá)［14］,引起IL－8的進(jìn)一步分泌，如此惡性循環(huán)，增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣管慢性炎癥和持續(xù)損傷。因此我們認(rèn)為，中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞在氣管腔內(nèi)的聚集和活化在COPD氣管炎癥的病理發(fā)展過程中均起到重要的作用，除PMN作用外，AM的作用不容忽視。因此，有效控制COPD氣管炎癥是COPD防治的關(guān)鍵。

近年來紅霉素應(yīng)用于彌漫性細(xì)支氣管炎中收到良好效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紅霉素能夠減輕局部氣管壁、氣管腔內(nèi)炎癥反應(yīng)。cc部位的作用與紅霉素相接近，高劑量組甚至比紅霉素組效果更為明顯。其作用機(jī)理可能與兩藥抑制炎性細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞的聚集與活化，以及其釋放相關(guān)炎性細(xì)胞因子的活動有關(guān)。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)，紅霉素和cc部位也僅部分改善氣管炎癥，尤其是氣管腔以中性粒細(xì)胞為主的炎癥。由于COPD發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，多種炎性細(xì)胞、黏附分子、細(xì)胞因子、酶和其他炎癥物質(zhì)等相互作用形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，彼此可以相互誘導(dǎo)或抑制其產(chǎn)生或表達(dá)，共同參與整個(gè)過程，形成炎癥瀑布效應(yīng)，并非單一藥物所能防治。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，cc部位和紅霉素均能使肺氣腫肺泡面積縮小，與模型組比較有顯著性差異。其可能的機(jī)制是否為清除自由基和拮抗TGF－β，減輕氣管細(xì)胞外基質(zhì)重塑，從而防止外周小氣管組織結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞，促進(jìn)肺泡修復(fù)，有待進(jìn)一步地深入研究。

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