實(shí)驗(yàn)一分光光度法

實(shí)驗(yàn)一分光光度法11.學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的使用方法2.掌握分光光度法測(cè)定未知溶液中蛋白質(zhì)的濃度

實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、紫外分光光度?--蛋白質(zhì)濃度測(cè)定2標(biāo)準(zhǔn)比較法分光光度法原理朗伯-比爾定律:吸光度液層厚度A=κ·d·c摩爾吸收系數(shù)溶液濃度

C未知=A未知A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，在紫外280nm處有最大吸收峰，吸收值與濃度成正比。用1cm石英比色杯，在280nm處測(cè)吸光度A，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照法測(cè)定蛋白濃度。3實(shí)驗(yàn)步驟空白管標(biāo)準(zhǔn)管BSA樣品管生理鹽水牛血清白蛋白未知蛋白質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)=500μg/mLC未知=（計(jì)算）A標(biāo)準(zhǔn)=（測(cè)定）A未知=（測(cè)定）先用空白管調(diào)零，在280nm處測(cè)已知濃度為C標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A標(biāo)準(zhǔn)、未知樣品的吸光度A未知，未知樣品的濃度C未知可按公式求得。4注意事項(xiàng)1.石英比色杯裝3/4溶液2.拉桿第1格（近自己）---空白管3.開(kāi)關(guān)“T”---開(kāi)蓋調(diào)%旋鈕→0.00蓋蓋調(diào)%旋鈕→100.04.開(kāi)關(guān)“A”---吸光度調(diào)“零”旋鈕→0.005.拉桿讀第2格（標(biāo)準(zhǔn)管）的吸光度A標(biāo)準(zhǔn)拉桿讀第3格（樣品管）的吸光度A未知根據(jù)公式計(jì)算未知蛋白質(zhì)的濃度C未知=A未知A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)5二、可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)有色溶液吸收光譜掌握單光束分光光度計(jì)檢測(cè)有色溶液吸收光譜的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)器材紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（752-S型）蘭色葡聚糖2000溶液坐標(biāo)紙7實(shí)驗(yàn)原理1.可見(jiàn)光譜分析要求被測(cè)溶液的顏色與所用的單色光互補(bǔ)，以求達(dá)到溶液對(duì)光的最大吸收2.紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是利用物質(zhì)對(duì)光的有選擇吸收現(xiàn)象，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，可在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描出溶液的吸收光譜圖3.蘭色葡聚糖2000溶液最大吸收峰為620nm8實(shí)驗(yàn)步驟開(kāi)蓋，開(kāi)機(jī)預(yù)熱20分鐘2.設(shè)定起始波長(zhǎng)500nm3.置入空白，樣品4.調(diào)0%T5.蓋蓋，調(diào)100%T6.置模式為“吸光度(A)”調(diào)07.樣品置入光路8.讀取A值后開(kāi)蓋9.依次選擇波長(zhǎng)：550nm、620nm

、650nm、700nm、750nm10.置模式為透射比(T)11.重復(fù)3~9步驟12.取坐標(biāo)紙，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制吸收光譜圖9結(jié)果與分析1.繪制蘭色葡聚糖2000的吸收光譜圖2.最大吸收峰值3.分析討論10分析討論11附圖METASHU