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分子生物學(xué)重點(diǎn)：最新期末試題第二章染色體與DNA

染色體（chromosome）是細(xì)胞在有絲分裂時(shí)遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。

真核生物的染色體在細(xì)胞生活周期的大部分時(shí)間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。

染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位—核小體(nucleosome)成串排列而成的。

原核生物(prokaryote)：DNA形成一系列的環(huán)狀附著在非組蛋白上形成類核。

染色體由DNA和蛋白質(zhì)組成。

蛋白質(zhì)由非組蛋白和組蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）

DNA和組蛋白構(gòu)成核小體。

組蛋白的一般特性：P24

①進(jìn)化上的保守性

②無(wú)組織特異性

③肽鏈氨基酸分布的不對(duì)稱性：堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。

④組蛋白的可修飾性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。

⑤H5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸（24%）(鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5)

組蛋白的可修飾性

在細(xì)胞周期特定時(shí)間可發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔?、H1有磷酸化作用。

所有這些修飾作用都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。

2、DNA

1)DNA的變性和復(fù)性

■變性（Denaturation)DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過程稱為變性。

■增色效應(yīng)(Hyperchromaticeffect)在變性過程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當(dāng)達(dá)到某一溫度時(shí)驟然上升，稱為增色效應(yīng)。

■融解溫度（Meltingtemperature，Tm)變性過程紫外線吸收值增加的中點(diǎn)稱為融解溫度。生理?xiàng)l件下為85-95℃

影響因素：GC含量，pH值，離子強(qiáng)度，尿素，甲酰胺等

■復(fù)性（Renaturation)熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復(fù)成雙鏈。

■減色效應(yīng)（Hypochromaticeffect)隨著DNA的復(fù)性，260nm紫外線吸收值降低的現(xiàn)象。

2)C值反?，F(xiàn)象（C-valueparadox)C值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。

真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反常現(xiàn)象”。

（四）核小體(nucleosome)：用于包裝染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，是由DNA鏈纏繞一個(gè)組蛋白核[（H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚體】構(gòu)成的。

1、原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

●基因組很小，大多只有一條染色體

●結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)煉

●存在轉(zhuǎn)錄單元(trnascriptionaloperon)

●多順反子(polycistron)

重疊基因由基因內(nèi)基因、部分重疊基因、一個(gè)堿基重疊組成。

2、真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

●真核基因組結(jié)構(gòu)龐大3×109bp、染色質(zhì)、核膜

●單順反子

●基因不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）、內(nèi)含子(intron)、外顯子(exon)

●非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1)

●含有大量重復(fù)序列

■不重復(fù)序列/單一序列：在基因組中有一個(gè)或幾個(gè)拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。

■中度重復(fù)序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101～104。如：rRNA、tRNA

一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達(dá)中起重要作用

■高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)達(dá)到幾百個(gè)到幾百萬(wàn)個(gè)。

●衛(wèi)星DNA：A?T含量很高的簡(jiǎn)單高度重復(fù)序列。

1、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：指4種脫氧核苷酸的連接及其排列順序，DNA序列是這一概念的簡(jiǎn)稱。堿基序列

2）特征：

●雙鏈反向平行配對(duì)而成

●脫氧核糖和磷酸交替連接，構(gòu)成DNA骨架，堿基排在內(nèi)側(cè)

●內(nèi)側(cè)堿基通過氫鍵互補(bǔ)形成堿基對(duì)（A：T，C：G）。

2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

2）分類：

右手螺旋：A-DNA，B-DNA

左手螺旋：Z-DNA

3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)：指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。

2）主要形式：超螺旋結(jié)構(gòu)（正超螺旋和負(fù)超螺旋）

（一）DNA的半保留復(fù)制（semi-nservativereplication）

1、定義：由親代DNA生成子代DNA時(shí)，每個(gè)新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。

3、DNA半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。

（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)

1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA

3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物

4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。

5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶

●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物

●反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)

●反應(yīng)需要有3-OH存在

●DNA鏈的合成方向?yàn)?3

性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ

3'5'外切活性

5'3'外切活性--

5'3'聚合活性中很低很高

新生鏈合成--

聚合酶Ⅰ主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時(shí)切除RNA引物并填補(bǔ)其留下的空隙。

聚合酶Ⅱ修復(fù)紫外光引起的DNA損傷

聚合酶ⅢDNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3→5’外切酶的校對(duì)功能，提高DNA復(fù)制的保真性

6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái)

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用

7、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopisomerase)：

拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的ε蛋白

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶

8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)：通過水解ATP獲得能量來(lái)解開雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。

rep蛋白沿3’5’移動(dòng)，而解螺旋酶I、II、III沿5’3’移動(dòng)。

9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。

（三）DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）

雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸

切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段

1、雙鏈的解開------ftju制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。ori(或o）、富含A、T的區(qū)段。

從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子

復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點(diǎn)，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱為復(fù)制叉

雙鏈解開、復(fù)制起始P44

大約20個(gè)DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個(gè)9bp保守序列相結(jié)合

在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個(gè)13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈

解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開DNA雙鏈

2、RNA引物的合成

DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。

引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸，

3、DNA鏈的延伸

DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication)：DNA復(fù)制時(shí)其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。

在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。

在DNA復(fù)制過程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。

4、切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段（復(fù)制終止）

當(dāng)復(fù)制叉遇到約22個(gè)堿基的重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus蛋白復(fù)合物能使DnaB不再將DNA解鏈，阻擋復(fù)制叉繼續(xù)前移。P47

在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補(bǔ)上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈

（四）復(fù)制的幾種主要方式P42

1、雙鏈環(huán)狀、θ型復(fù)制、雙向等速

2、滾環(huán)型：

（1）模板鏈和新合成的鏈分開;

（2）不需RNA引物，在正鏈3‘－OH上延伸

（3）只有一個(gè)復(fù)制叉;

3、D環(huán)復(fù)制---單向復(fù)制的特殊方式如：動(dòng)物線粒體DNA

（五）真核生物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)

1、真核生物每條染色體上有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，多復(fù)制子（約150bp左右）；

2、復(fù)制叉移動(dòng)的速度較慢（約50bp／秒），僅為原核生物的1／10。

3、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前,各個(gè)起始點(diǎn)不再重新開始DNA復(fù)制；真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。

4、真核生物有多種DNA聚合酶。

5、真核生物DNA復(fù)制過程中的引物及岡崎片段的長(zhǎng)度均小于原核生物。（真核岡崎片段長(zhǎng)約100-200bp，原核岡崎片段長(zhǎng)約1000-2000bp。）

（六）原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)比較

復(fù)制起點(diǎn)（ori）：原核一個(gè)，真核多個(gè)；

復(fù)制子：原核一個(gè)，真核多個(gè)；

復(fù)制子長(zhǎng)度：原核長(zhǎng)；真核短；

復(fù)制叉：原核多個(gè)；真核多個(gè)；

復(fù)制移動(dòng)速度：原核較快；真核較慢；

真核生物染色體在全部完成復(fù)制前，各起始點(diǎn)的DNA復(fù)制不能再開始。而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起點(diǎn)上可以連續(xù)開始新的DNA復(fù)制。

原核生物染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂同步，可以多次復(fù)制；真核生物染色體的復(fù)制發(fā)生在S期，是細(xì)胞分類的特定時(shí)期，而且僅此一次。

四、DNA的修復(fù)

DNA修復(fù)系統(tǒng)功能

錯(cuò)配修復(fù)恢復(fù)錯(cuò)配

堿基切除修復(fù)切除突變的堿基

核甘酸切除修復(fù)修復(fù)被破壞的DNA

DNA直接修復(fù)

SOS系統(tǒng)修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA

DNA的修復(fù)，導(dǎo)致變異1、錯(cuò)配修復(fù)（mismatchrepair）

●Dam甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化

●甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進(jìn)行（幾秒種后至幾分鐘內(nèi)）

●根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯(cuò)配堿基

2、堿基切除修復(fù)excisionrepair

所有細(xì)胞中都帶有不同類型、能識(shí)別受損核苷酸位點(diǎn)的糖苷水解酶，它能特意切除受損核苷酸上的N-β-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為AP位點(diǎn)。一些堿基在自發(fā)或誘變下會(huì)發(fā)生脫酰胺，然后改變配對(duì)性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變

腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)

鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)

胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對(duì)

3、核苷酸切除修復(fù)

1）通過特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位

2）由酶的復(fù)合物在損傷的兩邊切除幾個(gè)核苷酸

3）DNA聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈

4）DNA連接酶將切口補(bǔ)平

4、DNA的直接修復(fù)

在DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體

甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對(duì)

SOS反應(yīng)(SOSresponse)：是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，細(xì)胞為求生存而產(chǎn)生的一種應(yīng)急措施。包括誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。細(xì)胞癌變也與SOS反應(yīng)有關(guān)。兩個(gè)作用（1）DNA的修復(fù)；（2）產(chǎn)生變異

五、DNA的轉(zhuǎn)座

DNA的轉(zhuǎn)座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposableelement)介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)座子（transposonTn）：存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)座”這一命名并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來(lái)位置上，在新位點(diǎn)上出現(xiàn)的僅僅是它的拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA復(fù)制。

原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：

1、插入序列(IS)

IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子，不含有任何宿主基因，它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)

復(fù)合轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列3、TnA家族

TnA家族沒有IS序列、體積龐大(5000bp以上)、帶有3個(gè)基因，其中一個(gè)編碼β-內(nèi)酰胺酶(AmpR)，另兩個(gè)則是轉(zhuǎn)座作用所必須的。

(三）轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制

轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用的普遍特征，是受體分子中有一段很短的(3～l2bp)、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。

對(duì)于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來(lái)說，它所復(fù)制的靶序列長(zhǎng)度是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對(duì)的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。

靶序列的復(fù)制可能起源于特定內(nèi)切酶所造成的黏性DNA末端。

（三）轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)p63

（1）轉(zhuǎn)座引起插入突變（2）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因（3）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變（4）轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）：指通過RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可動(dòng)元件。

第三章生物信息的傳遞（上）——從DNA到RNA

轉(zhuǎn)錄(transcription)：生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)

原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)

模板:DNA

酶:RNA聚合酶

其他蛋白質(zhì)因子

RNA合成方向：5'到3'

轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。

與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。

DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。

轉(zhuǎn)錄單元（transcriptionunit）一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。

二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件

（一）RNA聚合酶

●原核生物RNA聚合酶（大腸桿菌為例）---全酶=核心酶σ因子

亞基基因相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能

αrpoA365002核心酶核心酶組裝，

啟動(dòng)子識(shí)別

βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成

RNA合成的活性中心

β'rpoC1550001核心酶

ω？11000（需查）1核心酶？

σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，

用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子

真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比較酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)α-鵝膏蕈堿的敏感性

RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感

RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)hnRNA20-40%敏感

RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性

RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別

RNA聚合酶DNA聚合酶

大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol

引物無(wú)有

產(chǎn)物較短，游離較長(zhǎng)，與模板以氫鍵相連

作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行

外切酶活性無(wú)5’3’，3’5’

校對(duì)合成能力無(wú)有

修復(fù)能力無(wú)有

（二）啟動(dòng)子(promoter)

啟動(dòng)子定義：指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

TATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開）

TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別的信號(hào)

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)---與新生RNA鏈第一個(gè)核甘酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基。

真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

核心啟動(dòng)子（corepromoter）

●定義：指保證RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū)

●作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始

2、上游啟動(dòng)子元件

●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等

●作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。

（三）轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物---二元閉合復(fù)合物、二元開鏈復(fù)合物、三元復(fù)合物。（原核）

三、轉(zhuǎn)錄的基本過程

1、起始位點(diǎn)的識(shí)別：RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。

RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合

2、轉(zhuǎn)錄起始

①RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合

DNA雙鏈解開

在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

5-pppG-OHNTP5-pppGpN-OH3ppi

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3

3、RNA鏈的延伸

●亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

●在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。

注意：9個(gè)核苷酸以前還在啟動(dòng)子區(qū)，容易脫落，一旦形成9個(gè)以上的核苷酸并離開啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄正式進(jìn)入眼神階段。

4、轉(zhuǎn)錄終止

終止子（terminator）：位于基因的末端，在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文序列（反向重復(fù)序列）約6-20bp。真核生物終止:由一段特定序列5′－AATAAA－3′和回文序列（反向重復(fù)序列）組成。

分為兩類：

●強(qiáng)終止子－內(nèi)部終止子：不依賴Rho(ρ)因子的終止。

●弱終止子－需要ρ因子（rhofactor），又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）

不依賴因子的終止

當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來(lái)，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。

終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，RNA的3’端為寡聚U

發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來(lái)。

依賴因子的終止

因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。

（二）、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程

1.轉(zhuǎn)錄起始

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。

（1）.轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段

順式作用元件(cis-actingelement)：影響自身基因表達(dá)活性的非編碼DNA序列。例：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、弱化子等

增強(qiáng)子：在啟動(dòng)區(qū)存在的能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始的DNA序列。但不是啟動(dòng)子的一部分。特點(diǎn)：1.遠(yuǎn)距離效應(yīng)；2.無(wú)方向性；3.順式調(diào)節(jié)；4.無(wú)物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。

（2）.轉(zhuǎn)錄因子：能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。

反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。

參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH

（3）轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。

（4）模板理論(piecingtheory)

一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性、有專一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。

2.轉(zhuǎn)錄延伸

真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。

RNA-pol前移處處都遇上核小體。

轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。

3.轉(zhuǎn)錄終止——和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。

四、轉(zhuǎn)錄后加工

5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的編輯

1、在5’端加帽

5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。

帽子結(jié)構(gòu)功能：

①能被核糖體小亞基識(shí)別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；

②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護(hù)mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。

2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA：

★準(zhǔn)確切割。?！锛觩oly（A）

多聚腺苷酸尾巴功能：

提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。

3、RNA的剪接

生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型：U-AG、AU-AC、Ⅰ類內(nèi)含子、Ⅱ類內(nèi)含子Ⅲ類內(nèi)含子

參與RNA剪接的物質(zhì)：snRNA（核內(nèi)小分子RNA）、snRNP（與snRNA結(jié)合的核蛋白）、核內(nèi)RNA（U1、U2、U4、U5、U6）

4、RNA的編輯

編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。

五、原核生物與真核生物mRNA的特征比較

1、原核生物mRNA的特征

●半衰期短

●多以多順反子的形式存在

單順反子mRNA：只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。

多順反子mRNA：編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。

Z：β-半乳糖苷酶Y：透過酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶

ZYA為結(jié)構(gòu)基因

●5’端無(wú)“帽子”結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的poly（A）結(jié)構(gòu)。

●SD序列：原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)。mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。P85

2、真核生物mRNA的特征

“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。

●5’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)

●多數(shù)mRNA3’端具有poly（A）尾巴（組蛋白除外）

●以單順反子的形式存在

六、RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)

相同點(diǎn)：

1、都以DNA鏈作為模板

2、合成的方向均為5’→3’

3、聚合反應(yīng)均是通過核苷酸之間形成的3’,5’-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長(zhǎng)。

不同點(diǎn)：

復(fù)制轉(zhuǎn)錄

模板兩條鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄

（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）

原料dNTPNTP

酶DNA聚合酶RNA聚合酶

產(chǎn)物子代雙鏈DNA

（半保留復(fù)制）mRNA，tRNA，rRNA

配對(duì)A-T；G-CA-U；T-A；G-C

引物RNA引物無(wú)第四章生物信息的傳遞（下）—從mRNA到蛋白質(zhì)

翻譯：指將mRNA鏈上的核甘酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開始，按每三個(gè)核甘酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。

蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所是核糖體。

蛋白質(zhì)合成的模板是mRNA

模板與氨基酸之間的接合體是tRNA

蛋白質(zhì)合成的原料是20種氨基酸

一、遺傳密碼?a?a三聯(lián)子

（一）三聯(lián)子密碼：mRNA鏈上每三個(gè)核甘酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核甘酸就稱為密碼子或三聯(lián)子密碼(tripletcoden)。

●至1966年，20種氨基酸對(duì)應(yīng)的61個(gè)密碼子和三個(gè)終止密碼子全部被查清。

（三）遺傳密碼的性質(zhì)

1、連續(xù)性

編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無(wú)間斷也無(wú)交叉。

基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致框移突變(frameshiftmutation)。

從mRNA5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)。

2、簡(jiǎn)并性

由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon）。

3、通用性與特殊性

蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。

已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。

4、擺動(dòng)性

轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA上的反密碼子需要通過堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼子反向配對(duì)結(jié)合，在密碼子與反密碼子的配對(duì)中，前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，第三對(duì)堿基有一定的自由度，可以“擺動(dòng)”，這種現(xiàn)象稱為密碼子的擺動(dòng)性。

二、tRNA的結(jié)構(gòu)、功能與種類

（一）tRNA的結(jié)構(gòu)

1、二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形2、三級(jí)結(jié)構(gòu)：“L”形

（二）tRNA的功能

1、解讀mRNA的遺傳信息

2、運(yùn)輸?shù)墓ぞ?，運(yùn)載氨基酸

tRNA有兩個(gè)關(guān)鍵部位：

●3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。

●與mRNA結(jié)合部位—反密碼子部位

tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼子相識(shí)別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。

1、起始tRNA和延伸tRNA

能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA稱起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。

真核生物：起始密碼子AUG所編碼的氨基酸是Met，起始AA-tRNA為Met-tRNAMet。

原核生物：起始密碼子AUG所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA為fMet-tRNAfMet

2、同工tRNA

代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。

同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶識(shí)別（P119）。

3、校正tRNA

無(wú)義突變校正tRNA：可以通過改變反密碼子區(qū)校正無(wú)義突變

錯(cuò)義突變校正tRNA：通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。

無(wú)義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱為無(wú)義突變。

錯(cuò)義突變：由于結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯(cuò)義突變。

GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）

四、氨酰-tRNA合成酶

AA-tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，它既能識(shí)別tRNA，又能識(shí)別氨基酸，對(duì)兩者都具有高度的專一性。

三、核糖體的結(jié)構(gòu)與功能

核糖體是由rRNA（ribosomalribonucleicacid）和多種蛋白質(zhì)結(jié)合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，蛋白質(zhì)肽鍵的合成就是在這種核糖體上進(jìn)行的。

細(xì)菌是70s{50s\30s}哺乳動(dòng)物是80s{60s\\40s}

（二）核糖體的功能：

合成蛋白質(zhì)

在單個(gè)核糖體上，可化分多個(gè)功能活性中心，在蛋白質(zhì)合成過程中各有專一的識(shí)別作用和功能。

●mRNA結(jié)合部位——小亞基

●結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）——大亞基

●結(jié)合或接受肽基tRNA的部位——大亞基

●肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）——大亞基

●形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）——大亞基四、蛋白質(zhì)合成的過程(生物學(xué)機(jī)制）

氨基酸的活化

翻譯的起始

肽鏈的延伸

肽鏈的終止

蛋白質(zhì)前體的加工

(一)氨基酸的活化

原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸

起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet

真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸

起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet

(二)翻譯的起始

原核生物（細(xì)菌）為例：

所需成分：30S小亞基、50S大亞基、模板mRNA、

fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2

翻譯起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、

翻譯起始(翻譯起始復(fù)合物形成)又可被分成3步：（P129）

1.核蛋白體大小亞基分離

2、30S小亞基通過SD序列與mRNA模板相結(jié)合。

3.在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)。

4、帶有tRNA、mRNA和3個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。真核生物翻譯起始的特點(diǎn)

●核糖體較大,為80Ｓ；

●起始因子比較多；

●mRNA5′端具有m7Gppp帽子結(jié)構(gòu)

●Met-tRNAMet

●mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端polyA都參與形成翻譯起始復(fù)合物；

真核生物翻譯起始復(fù)合物形成(區(qū)別原核生物)

原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物（P131）。

(三)肽鏈的延伸

肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個(gè)氨基酸就是一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。

延伸因子(elongationfactor,EF)：

原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)、EF-G

真核生物：EF-1、EF-2

1、AA-tRNA與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts兩種延伸因子

2、肽鍵形成：是由轉(zhuǎn)肽酶/肽基轉(zhuǎn)移酶催化

3、移位：核糖體向mRNA3’端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。

需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子

A位點(diǎn)是新到來(lái)的氨酰-tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。

P位點(diǎn)是肽酰-tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。

E位點(diǎn)是延伸過程中釋放tRNA的位點(diǎn)，即，去氨酰-tRNA通過E位點(diǎn)脫出，釋放到核糖體外的胞質(zhì)中。

（四）肽鏈的終止

RF1：識(shí)別終止密碼子UAA和UAG

終止因子RF2：識(shí)別終止密碼子UAA和UGA

RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放

真核生物只有一個(gè)終止因子（eRF）

(五)蛋白質(zhì)前體的加工

1、N端fMet或Met的切除

2、二硫鍵的形成

3、特定氨基酸的修飾

磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化和羧基化

4、切除新生肽鏈中非功能片段

（六）蛋白質(zhì)折疊

由核糖體合成的所有新生肽鏈必須通過正確的折疊才能形成動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的三位構(gòu)象，從而表現(xiàn)出生物學(xué)活性或功能。

新生多肽→一級(jí)結(jié)構(gòu)→二級(jí)結(jié)構(gòu)→三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)具有活性→（對(duì)于寡聚蛋白需要組裝稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)才有活性。

(七)蛋白質(zhì)合成抑制劑

青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)。

氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。氯霉素有時(shí)也用于治病，但劑量和周期受到較嚴(yán)控制。

五、蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制

1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制

2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制

(1)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)

(2)葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)

3、核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制

4、蛋白質(zhì)的降解

?*蛋白質(zhì)的合成位點(diǎn)與功能位點(diǎn)常常被細(xì)胞內(nèi)的膜所隔開，蛋白質(zhì)需要運(yùn)轉(zhuǎn)。

?*核糖體是真核生物細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，任何時(shí)候都有許多蛋白質(zhì)被輸送到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個(gè)部分，補(bǔ)充和更新細(xì)胞功能。

?*細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無(wú)誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。

?*細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成：絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中合成；一小部分在細(xì)胞器（葉綠體和線粒體）中合成。

?*定位于細(xì)胞器內(nèi)的大部分蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成，細(xì)胞器內(nèi)合成的留在細(xì)胞器內(nèi)。

?*蛋白質(zhì)插入或穿過生物膜的過程稱為蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)（proteintranslocation）。

蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的兩種方式

翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步（co-translationaltranslocation）

◆是即將進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的易位方式；

◆蛋白質(zhì)正合成的時(shí)候就可與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合；

◆蛋白質(zhì)合成時(shí)，核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，稱膜結(jié)合核糖體(membrane-boundribosome）。

◆分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)?/p>

翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)（post-translationaltranslocation）

◆蛋白質(zhì)翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴(kuò)散至合適的靶膜并與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合。

◆蛋白質(zhì)合成時(shí)，其核糖體不與任何細(xì)胞器相連，稱游離核糖體(freeribosome)

◆在細(xì)胞器發(fā)育過程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)摹?/p>

◆參與生物膜形成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制鑲?cè)肽?nèi)。

蛋白性質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制主要類型分泌蛋白質(zhì)在結(jié)合核糖體上合成，并以翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)輸免疫球蛋白、卵蛋白、

水解酶、激素等細(xì)胞器發(fā)育蛋白質(zhì)在游離核糖體上合成，以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸核、葉綠體、線粒體、

乙醛酸循環(huán)體、過氧化物酶

體等細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)

膜的形成兩種機(jī)制兼有質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、類囊體

中的蛋白質(zhì)

1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制

信號(hào)肽假說

●信號(hào)肽：能啟動(dòng)蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的任何一段多肽。（常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端氨基酸序列（有時(shí)不一定在N端））。

●絕大部分被運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)信號(hào)肽。

●信號(hào)序列特點(diǎn)：

（1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸；

（2）在靠近該序列N-端常常有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；

（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）。

●信號(hào)肽假說內(nèi)容：

（1）蛋白質(zhì)合成起始首先合成信號(hào)肽

（2）SRP（信號(hào)識(shí)別蛋白）與信號(hào)肽結(jié)合，翻譯暫停

（3）SRP與SRP受體結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開始

（4）信號(hào)肽進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)

（5）蛋白質(zhì)過膜，信號(hào)肽被切除，翻譯繼續(xù)進(jìn)行

（6）蛋白質(zhì)完全過膜，核糖體解離

信號(hào)肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系P144

（1）完整信號(hào)肽是保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件；

（2）僅有信號(hào)肽不足以保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生；

（3）信號(hào)序列切除并不是轉(zhuǎn)運(yùn)所必需；

（4）并非所有運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)都有可降解的信號(hào)肽。

蛋白質(zhì)翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步運(yùn)輸?shù)幕具^程

可分兩個(gè)階段：

首先：帶有新生肽鏈的核糖體與膜結(jié)合；

然后：新生肽鏈進(jìn)入膜通道并易位。

核糖體與膜結(jié)合需要信號(hào)識(shí)別顆粒（signalrecognitionparticle,SRP）。

SRP有兩種能力：

◆結(jié)合新合成的分泌型蛋白的信號(hào)序列；

◆結(jié)合位于膜上的SRP受體。

2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制前導(dǎo)肽及其特性:?翻譯后跨膜易位的蛋白質(zhì)，前體一般含前導(dǎo)肽(leaderpeptide)，前導(dǎo)肽在跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)中起重要作用。?過膜后，前導(dǎo)肽水解，蛋白質(zhì)變?yōu)橛泄δ艿牡鞍踪|(zhì)。

前導(dǎo)肽的一般特性：

（1）帶正電荷堿性氨基酸（Arg）較豐富，分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；

（2）缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；

（3）羥基氨基酸（Ser）含量較高；

（4）有形成兩親（親水和疏水）α-螺旋能力。

線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)

Hsp70為分子伴侶

分子伴侶：結(jié)合在一些不完全裝配或不恰當(dāng)折疊蛋白上，幫助它們折疊或防止它們聚集的蛋白質(zhì)。

分子伴侶的生物學(xué)功能

(1)幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊

(2)糾正錯(cuò)誤折疊或介導(dǎo)其降解

泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme，E1)

泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugatingenzyme，E2)

泛素蛋白連接酶(ubiquitin-proteinligatingenzyme,E3)

E1,E2,E3的作用：

E1激活泛素分子，

E2就負(fù)責(zé)把泛素分子綁在被降解蛋白質(zhì)上。

E3能識(shí)別被降解的蛋白質(zhì)。

第五章分子生物學(xué)研究法

﹡重組DNA技術(shù)-基因工程

﹡分子雜交及相關(guān)技術(shù)

﹡聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理和應(yīng)用

﹡DNA多態(tài)性及其檢測(cè)

基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等。

基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)。

基因工程技術(shù)實(shí)際上是核酸操作技術(shù)的一部分。

1、理論上的三大發(fā)現(xiàn)

遺傳物質(zhì)主要是DNA

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制

遺傳密碼子的破譯

2、技術(shù)上的三大發(fā)明

限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片斷

質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片斷克隆

逆轉(zhuǎn)錄酶的使用

①常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA

DNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵

DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端

反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成

多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記

末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾

堿性磷酸酶切除末端磷酸基

②載體vector

自我復(fù)制

克隆載體、表達(dá)載體

原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）

真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN

載體的條件

分子?。?0Kb）

有限制酶酶切位點(diǎn)

可自主復(fù)制

有足夠的copy數(shù)

帶篩選的標(biāo)志

1982年--轉(zhuǎn)基因小鼠

1997年克隆綿羊“多利”

1998年--克隆鼠

2001年2月--人類基因組

重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)。

重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。

這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等。

基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)。

基因工程技術(shù)實(shí)際上是核酸操作技術(shù)的一部分?；蛘哒f基因操作技術(shù)服務(wù)于基因工程。

一、限制酶

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。

發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。

1、限制酶的命名

命名原則：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。如：

屬名菌株名

EcoRI

種名編號(hào)

EcoRI來(lái)源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。

2、限制酶的特點(diǎn)：

（1）.限制性內(nèi)切酶一般識(shí)別完全的回文結(jié)構(gòu)，它具有兩個(gè)基本特點(diǎn)：

①能夠在中間劃一個(gè)對(duì)稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對(duì)稱互補(bǔ)配對(duì)；

②兩條互補(bǔ)鏈的5’—3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180度，則兩條鏈重疊。

（2）.識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。

（3）切割方式有兩種

①錯(cuò)位切割，產(chǎn)生互補(bǔ)性的粘性末端。

錯(cuò)位切割所產(chǎn)生的DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進(jìn)，這種末端稱為黏性末端。帶有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互補(bǔ)配對(duì)，連接成新的重組分子。

②沿對(duì)稱軸切割，產(chǎn)生平齊末端

切割后，DNA末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸，成為突出末端，又稱粘性末端包括3’突出、5’突出。

切割兩條鏈時(shí)產(chǎn)生兩端平整的DNA分子，稱為平末端。

（4）具有同裂酶

來(lái)源不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別同樣的核甘酸靶序列。

如：BamHI和BstI具有相同的識(shí)別序列GGATCC。

（5）具有同尾酶

來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不同，但卻產(chǎn)生相同的黏性末端，故同尾酶產(chǎn)生的黏性末端可以連接起來(lái)，但一般不能再被原來(lái)的任何一種酶所切割。

如：TaqI、ClaI和AccI為一組同尾酶，其中任何一種酶切割DNA分子都產(chǎn)生5′端CG凸出的粘性末端。

二、目的基因及載體（一）目的基因

（一）目的基因的獲得

1）化學(xué)合成法：

較短的基因（60-80bp）

用途：PCR引物、測(cè)序引物、定點(diǎn)突變、核酸雜交探針

1）DNA的化學(xué)合成

單鏈DNA短片段的合成已成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。

化學(xué)合成DNA分子是把新的脫氧核糖核苷酸加到DNA雙鏈的5’端，而在細(xì)胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。

整個(gè)DNA的化學(xué)合成過程可以在一個(gè)反應(yīng)柱上連續(xù)進(jìn)行，并且可以對(duì)合成過程進(jìn)行計(jì)算機(jī)控制。

目前常用的化學(xué)合成DNA的方法是磷酰胺法。

2）基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)

基因庫(kù)，也叫基因組文庫(kù)，DNA文庫(kù)（DNAlibrary)

是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長(zhǎng)期以重組體方式保持在適當(dāng)?shù)乃拗髦小?/p>

將生物細(xì)胞基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。這樣保存的基因組是多拷貝、多片段，當(dāng)需要某一片段時(shí)，可以在這樣的“圖書館”中查找（沒有目錄）。

cDNA文庫(kù)首先獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)克隆后形成文庫(kù)。

cDAN文庫(kù)和基因組文庫(kù)的不同之處在于，cDNA文庫(kù)除卻了mRNA拼接過程中除去的內(nèi)含子等成分，便于DNA重組的使用。其復(fù)雜性比基因文庫(kù)低得多。

主要用于研究蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可根據(jù)克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出來(lái)。

組建一個(gè)cDNA文庫(kù)的步驟：

1)分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞

2)從組織或細(xì)胞中制備總體RNA和mRNA

3）第一條cDNA鏈的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆轉(zhuǎn)錄酶，4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液(Mg2)等。

4)第二條cDNA鏈的合成

5)cDNA的甲基化和接頭的加入

6)雙鏈cDNA與載體的連接

（二）載體

載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。

載體具以下特征：

1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；（質(zhì)粒大于15kb時(shí)，其將外源DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌的效率將大大降低。）

2)有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；

3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）。

4）可以在載體細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，即本身是一個(gè)復(fù)制子。

基因工程載體的分類

根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分

（1）.質(zhì)粒型載體—環(huán)狀dsDNA分子，自主復(fù)制（質(zhì)粒DNA載體）。如：質(zhì)粒載體

（2）.病毒型載體—環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒。如：噬菌體載體

（3）.混合型載體—具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性。如：柯斯質(zhì)粒載體

用于原核生物宿主的載體目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體主要有：

質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體。

（一）.質(zhì)粒（plasmid）：質(zhì)粒是細(xì)胞染色體或核區(qū)DNA外能夠自主復(fù)制的很

質(zhì)粒載體特點(diǎn)

1、至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。

2、至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。

3、至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。

4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。

注：前三個(gè)特點(diǎn)必不可少。

1、標(biāo)記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

2、標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr

2）生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ

3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制

1)四環(huán)素抗性基因（Tetr，Tcr）

2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr，Apr）

3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）

4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）三DNA重組基本程序

1.分—載體和目的基因的分離

2.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

3.接—載體與目的基因連接成重組體

4.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞

5.篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定

6.表－目的基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)

目的基因的獲取方法：從基因組中提取、CDNA法、化學(xué)合成法、PCR法。

鑒定得到的目的基因的鑒定方法：抗性選擇、提取質(zhì)粒電泳鑒定大小、快速提取酶切鑒定、菌落雜交法、DNA序列分析。

第二節(jié)分子雜交及相關(guān)技術(shù)

分子雜交：是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交,經(jīng)顯影后顯示出目的分子所處的位置的過程.

分子雜交包括：DNA-DNA雜交（原位雜交、點(diǎn)雜交、Southern雜交），DNA-RNA雜交（Northern雜交）及蛋白雜交（Western雜交）等。

一、雜交探針（Probe）的獲得

Probe：探針，是由放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記后，能與目的基因片段特異性雜交的已知序列的核酸片段。

根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。

DNA探針：

DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

可從已建立的基因組文庫(kù)中篩選分離并克隆制備。

cDNA探針（complementaryDNA）：cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對(duì)）。

可以從已構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中篩查和分離目的基因探針。

RNA探針：

RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。

寡核苷酸探針：

根據(jù)已知基因序列，人工合成一段互補(bǔ)的DNA片段。一般長(zhǎng)約15～50個(gè)bp

RNA探針和cRNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。前三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。

三、DNA雜交常用的方法

用途：用于快捷地檢查出菌落中是否有某個(gè)基因，但不能檢出基因的大小或重復(fù)的程度。

（二）.SouthernDNA印跡雜交

將重組體DNA用限制酶切割，分離出目的DNA后進(jìn)行電泳分離，再將其原位轉(zhuǎn)至薄膜上，固定后用探針雜交的方法叫Southern雜交。

用途：用來(lái)檢查DNA樣品中是否存在有某個(gè)特定的基因，而且還可知道其大小及酶切位點(diǎn)的分布。

SouthernDNA印跡雜交主要步驟：

DNA提取，限制性內(nèi)切酶切割成DNA片段。

DNA電泳。

印跡，將進(jìn)行DNA電泳的凝膠置于印跡設(shè)備中，緩沖液內(nèi)含有堿，在印跡過程中DNA變性，變成單鏈DNA。凝膠上的DNA分子通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用被原封不動(dòng)地“吸印”到濾膜上。

80℃烘烤1-2小時(shí)，DNA片段牢固結(jié)合到膜上。

帶有DNA的濾膜與雜交探針一起溫育，探針與DNA結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的游離探針。

用X光底片曝光后所得的放射性自顯影圖片，同溴化乙錠染色的凝膠譜帶進(jìn)行對(duì)照比較，便可鑒定出那一條限制片段是與探針核苷酸同源的。

（三）.菌落印跡原位雜交(insituhybridization)

讓含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放出DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法叫原位雜交。

用途：用于在轉(zhuǎn)化菌落中篩選帶有目的基因的重組克隆

四、RNA雜交常用方法

NorthernRNA印跡雜交：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法，被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA或RNA.

用途：用來(lái)檢查基因組中某個(gè)特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄。

原理及步驟：提取總RNA、提純分離mRNA、瓊脂糖凝膠電泳分離RNA、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜、雜交檢測(cè)

關(guān)于印跡技術(shù)的概念

印跡是將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定在固體支持物的過程。

印跡的目的是減少待測(cè)物質(zhì)的流動(dòng)性，防止丟失、擴(kuò)散，保持原有的位置，便于反復(fù)使用，容易進(jìn)行斑點(diǎn)和序列分析，簡(jiǎn)化分離手續(xù)。

Southern雜交、Northern雜交和Western印跡、Eastern印跡實(shí)際上都是印跡技術(shù)。但印記轉(zhuǎn)移的目標(biāo)物質(zhì)不同，鑒別方法也不同。

五、蛋白質(zhì)印跡法（Westernbloting)

Westernblotting分析(p189)

是蛋白質(zhì)分析的技術(shù)在基因表達(dá)研究中，應(yīng)用非常廣泛，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是基因的產(chǎn)物，研究蛋白質(zhì)的變化來(lái)分析判斷基因轉(zhuǎn)錄的高與低。

步驟：細(xì)胞→提取總蛋白質(zhì)→聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜（Westernblotting，常用醋酸纖維膜）→固定→用化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記（抗體抗原反應(yīng)）→分析相對(duì)量以判斷表達(dá)量的多少。

第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。

體外程序化的DNA合成技術(shù)。

1.增效PCR（boosterPCR）2.巢式PCR（nestPCR）3、多重PCR4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(retro-transcriptionPCR，簡(jiǎn)稱RTPCR)5.不對(duì)稱PCR6.反向PCR7、錨定PCR（AnchoredPCR,A-PCR）

先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個(gè)PolyG尾巴，所用引物是具5’-polyC尾巴，可以與PolyG尾巴結(jié)合，是一個(gè)固定點(diǎn)，無(wú)論其余部分序列如何，只識(shí)別片段末端，由此進(jìn)行PCR擴(kuò)增，叫錨定PCR。

錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列.

PCR技術(shù)的應(yīng)用1.遺傳性疾病的基因診斷2.傳染病的診斷(肝炎病毒)3.癌基因檢測(cè)4.法醫(yī)學(xué)(親子鑒定)上的應(yīng)用5.DNA測(cè)序6.基因克隆7.引入基因點(diǎn)突變,基因融合等

第四節(jié)DNA多態(tài)性（DNAPolymorphism）

群體中每個(gè)個(gè)體（體細(xì)胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一個(gè)是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。

除一卵雙生子外，沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。

DNA多態(tài)性有兩類：

1.位點(diǎn)多態(tài)性：

是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換），單個(gè)堿基的置換、缺失和插入。

突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個(gè)堿基的置換又稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。

2.序列長(zhǎng)度多態(tài)性：

又稱可變數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTRS），重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)。

VNTR兩側(cè)的酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。

PCR-SSCP(Single-StrandedConformationPolymorphroism)

SSCP：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性

是指單鏈DNA由于堿基序列不同而引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測(cè)。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。

基因芯片，又稱生物芯片，DNA芯片，DNA探針微陣列（Microarray）。它集成了大量的密集排列的基因探針，這些探針位于芯片的特定位點(diǎn)上，可與被熒光標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，利用基因芯片雜交圖象，可以確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識(shí)別?；蛐酒茉谕粫r(shí)間內(nèi)分析大量的基因，實(shí)現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測(cè)。

1.基因組掃描

2.尋找基因功能

3.基因型及單堿基多態(tài)（SNP）

4.突變檢測(cè)

5.基因表達(dá)

6.基因測(cè)序

7.藥物篩選

幾乎所有的生物學(xué)研究領(lǐng)域。作為一種高通量的基因檢測(cè)方法，具有巨大的應(yīng)用潛力。

第六章原核生物基因表達(dá)調(diào)控

基因表達(dá)(geneexpression)：在一定調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生其RNA產(chǎn)物，如tRNA、rRNA等的過程。

大多數(shù)基因的表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì),部分基因如tRNA和rRNA基因表達(dá)產(chǎn)物是RNA。

二、基因表達(dá)調(diào)控

圍繞基因表達(dá)過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都通稱為基因表達(dá)調(diào)控.

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控

翻譯水平的調(diào)控

DNA水平包括基因丟失、基因重排、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

RNA水平包括轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)動(dòng)、mRNA穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)水平包括翻譯過程；翻譯后加工的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

三、基因表達(dá)的特性：

1）時(shí)間特異性或階段特異性

2）空間特異性或組織細(xì)胞特異性

1、時(shí)間特異性

按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的時(shí)間特異性(temporalpecificity)。

多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。

2、空間特異性（spatialspecificity）:

在個(gè)體生長(zhǎng)全過程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達(dá)的空間特異性(spatialspecificity)。

基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。

四、基因表達(dá)的方式

組成性基因表達(dá)

適應(yīng)性表達(dá)（誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)）

1、組成性基因表達(dá)

指不大受環(huán)境變動(dòng)而變化的一類基因的表達(dá)。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必須的蛋白質(zhì)或酶的表達(dá)。

某些基因在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因(house-keepinggene)。如：微管蛋白基因、糖酵解酶系基因、核糖體蛋白基因等。

2、適應(yīng)性表達(dá)（誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)）

指環(huán)境的變化容易使其表達(dá)水平變動(dòng)的一類基因表達(dá)。

誘導(dǎo)表達(dá)（induction）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導(dǎo)基因。

阻遏表達(dá)（repression）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因。

在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無(wú)論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)，即為協(xié)調(diào)表達(dá)(coordinateexpression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordinateregulation)。

五、基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：

1.基因表達(dá)調(diào)控的多層次和復(fù)雜性

四個(gè)基本調(diào)控點(diǎn)

（1）基因結(jié)構(gòu)的活化

（2）轉(zhuǎn)錄起始：最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)

（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)

（4）翻譯及翻譯后加工

2.基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素

基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，生物個(gè)體或細(xì)胞所處的內(nèi)、外環(huán)境，以及細(xì)胞內(nèi)所存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)。

三個(gè)基本要素：

1）特異的DNA調(diào)節(jié)序列

2）調(diào)節(jié)蛋白

3）RNA聚合酶

基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素

1、特異DNA序列

原核生物的操縱子

真核生物的順式作用元件

2、調(diào)節(jié)蛋白

真核生物的順式作用元件：是指可影響自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列。通常是非編碼序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及沉默子等

2、調(diào)節(jié)蛋白

是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、真核生物的基本轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子等。

3、RNA聚合酶

原核啟動(dòng)序列或真核啟動(dòng)子是由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。

啟動(dòng)序列影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起動(dòng)的頻率。

六、基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義

1、適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖

2、維持個(gè)體發(fā)育與分化

基因表達(dá)調(diào)控

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控

原核生物主要是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達(dá)。

當(dāng)需要某種基因產(chǎn)物時(shí)，就大量合成這種mRNA，當(dāng)不需要這種基因產(chǎn)物時(shí)就抑制這種mRNA的轉(zhuǎn)錄，就是讓相應(yīng)的基因不表達(dá)。

通常所說的基因不表達(dá)，并不是說這個(gè)基因就完全不轉(zhuǎn)錄為mRNA，而是轉(zhuǎn)錄的水平很低，維持在一個(gè)基礎(chǔ)水平（本底水平）。

基因表達(dá)完全關(guān)閉的情況使極為少見的。

1、負(fù)調(diào)控negativeregulation

在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因是表達(dá)的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被關(guān)閉，這樣的控制系統(tǒng)就叫做負(fù)控系統(tǒng)。

其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做阻遏蛋白

兩種類型：負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏

2、正調(diào)控positiveregulation

在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因是關(guān)閉的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的控制系統(tǒng)就叫做正控系統(tǒng)。

其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（激活蛋白)

兩種類型:正控誘導(dǎo)和正控阻遏系統(tǒng)

（二）特殊代謝物調(diào)節(jié)基因表達(dá)的類型

1、可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來(lái)關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。

調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時(shí)受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié)

2、可阻遏調(diào)節(jié)

一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來(lái)開啟的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉狀態(tài)，基因的表達(dá)被阻遏.

調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子

（三）原核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)

調(diào)節(jié)的主要環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行

σ因子決定RNA聚合酶識(shí)別特異性

主要通過操縱子模式進(jìn)行調(diào)節(jié)

阻遏蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用（阻遏機(jī)制）是普遍存在的負(fù)調(diào)控作用

原核生物中基因的組織形式

幾個(gè)作用相關(guān)的基因在染色體上串連排列在一起，由同一個(gè)調(diào)控系統(tǒng)來(lái)控制。

這樣的一個(gè)整體稱為一個(gè)操縱元(operon)。

二、弱化子對(duì)基因活性的影響

1、弱化子

在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當(dāng)操縱子被阻遏時(shí)，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)作用.

2、弱化子作用機(jī)制

RNA分子在分子內(nèi)采用不同的堿基配對(duì)方式，形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而參與調(diào)控。

當(dāng)不同的結(jié)構(gòu)對(duì)是否允許終止存在差異時(shí)，改變二級(jí)結(jié)構(gòu)可對(duì)轉(zhuǎn)錄終止進(jìn)行調(diào)控

三、降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié)

1、葡萄糖效應(yīng)（降解物抑制作用）

是指當(dāng)葡萄糖和其它糖類一起作為細(xì)菌的碳源時(shí)葡萄糖總是優(yōu)先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類的利用的現(xiàn)象。

2、降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié)

葡萄糖通過降低cAMP的含量而抑制基因表達(dá)

四、細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

1、細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

指細(xì)菌在惡劣生長(zhǎng)環(huán)境中關(guān)閉tRNA和核糖體形成的能力。

2、細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)的機(jī)制

應(yīng)急信號(hào)：

鳥苷四磷酸（ppGpp）、鳥苷五磷酸（pppGpp）

誘導(dǎo)物：空載tRNA

乳糖操縱子模型

1、Z、Y、A基因的產(chǎn)物為一條多順反子mRNA

lacZ：編碼β-半乳糖苷酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖；

lacY：編碼半乳糖苷透性酶，它能將乳糖運(yùn)送透過細(xì)菌的細(xì)胞壁；

lacA：編碼硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)行乳糖代謝。

cAmp-CAP代謝激活蛋白（Cataboliteactivatingprotein,CAP）是cAmp的受體蛋白（cyclicAmpreceptorprotein,CRP）

cAmp-CAP復(fù)合物，是lac操縱元的正調(diào)控因子

4、葡萄糖對(duì)lac操縱子的影響

葡萄糖腺苷酸環(huán)化酶活性降低ATP無(wú)法轉(zhuǎn)變成cAMP不能形成CAP-cAMP復(fù)合蛋白R(shí)NA酶無(wú)法結(jié)合在DNA上結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)。

代謝物阻遏效應(yīng)

研究認(rèn)為葡萄糖的某些降解產(chǎn)物抑制lacmRNA的合成，這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng).

特殊代謝物調(diào)節(jié)基因活性的類型

可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時(shí)受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié)

可阻遏調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子

（三）trp操縱子的阻遏調(diào)控機(jī)制

色氨酸操縱子主要參與調(diào)控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏色氨酸時(shí)，此操縱子開放，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)合成的色氨酸過多時(shí)，此操縱子被關(guān)閉。

色氨酸操縱子的調(diào)控機(jī)制與乳糖操縱子類似，但通常情況下，操縱子處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合而阻遏轉(zhuǎn)錄。

而當(dāng)色氨酸合成過多時(shí)，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結(jié)合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結(jié)合而使基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。

（一）弱化子

在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當(dāng)操縱子被阻遏時(shí)，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)作用.

（四）轉(zhuǎn)錄的弱化作用

mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導(dǎo)肽基因的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)的。

在前導(dǎo)肽基因中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，故這個(gè)前導(dǎo)肽的翻譯必定對(duì)tRNATrp的濃度敏感。

（五）衰減子的生物學(xué)意義

活性阻遏物和非活性阻遏物的轉(zhuǎn)變可能較慢，而tRNA負(fù)載與否可能更為靈敏；

氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而以tRNA負(fù)載情況為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行控制可能更為恰當(dāng).

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸高于某一水平時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)完全的阻遏；而只有低于這一水平時(shí)，才需用衰減子這個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，阻遏蛋白和衰減子調(diào)節(jié)機(jī)制都是為了避免浪費(fèi)，提高效率。

第七章真核生物基因表達(dá)調(diào)控

基因表達(dá)(geneexpression)--基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。

rRNA、tRNA的合成屬于基因表達(dá)

真核生物基因表達(dá)的調(diào)控的水平

DNA水平的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

翻譯水平的調(diào)控

翻譯后水平的調(diào)控

真核基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1、在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。

2、真核細(xì)胞DNA都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸露的。

3、高等真核細(xì)胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。

4、真核生物能有序地根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA片段重排，還能在需要時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。

5、在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對(duì)較大，一般通過改變整個(gè)所控制基因5‘上游區(qū)DNA構(gòu)型來(lái)影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動(dòng)子上游不遠(yuǎn)處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上可直接促進(jìn)或抑RNA聚合酶與它的結(jié)合。

6、真核生物的RNA在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。

7、許多真核生物的基因只有經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)。

一、基因家族：真核基因組中來(lái)源相同,結(jié)構(gòu)相似,功能相關(guān)的一組基因.可能由某一共同祖先基因經(jīng)重復(fù)和突變產(chǎn)生。

◆特點(diǎn)：

◆家族成員可以分布于不同染色體上

◆可集中于一條染色體上,串聯(lián)排列在一起,形成基因簇(genecluster)

◆有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物,這種基因稱為

假基因(Pseudogene)．Ψa1：與a1相似的假基因基因家族的種類

1、簡(jiǎn)單的多基因家族

以串聯(lián)方式前后相連

rRNA

2、復(fù)雜的多基因家族

一般由幾個(gè)相關(guān)基因家族構(gòu)成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位.

組蛋白基因家族

3、發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族

珠蛋白肽鏈有7種：α、β、γ（Gγ、Aγ）、δ、ε、ζ。

α鏈141AA合成α、ζ

β鏈146AA合成β、γ（Gγ、Aγ）、δ、ε

（三）外顯子與內(nèi)含子的可變調(diào)控

1、組成型剪接

概念：切除內(nèi)含子后，將外顯子規(guī)范地拼接成成熟的mRNA，稱為組成型拼接。這樣一個(gè)基因只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，也只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

2、選擇性剪接

概念：可調(diào)控的選擇性拼接，因而產(chǎn)生不同的成熟mRNA，翻擇產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。

三、真核生物DNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控

“開放”型活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響

基因擴(kuò)增

基因重排與轉(zhuǎn)換

基因丟失

（二）基因擴(kuò)增

1、概念：基因擴(kuò)增是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，它使得細(xì)胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要，是基因活性調(diào)節(jié)的一種方式.

作用：滿足特定階段生命活動(dòng)的需要

2、實(shí)例：非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的rRNA基因、果蠅的發(fā)育中，卵殼蛋白基因

（三）基因重排與變換

1、基因重排

概念：一個(gè)基因可以從遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子的地方移到距它很近的位點(diǎn)而被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，即在DNA水平上由無(wú)功能的基因片斷組合重排成為有功能的基因單位的過程，叫做基因重排。

2、