藥用植物分子鑒定詳解演示文稿

藥用植物分子鑒定詳解演示文稿本文檔共94頁；當前第1頁；編輯于星期三\16點47分（優(yōu)選）藥用植物分子鑒定本文檔共94頁；當前第2頁；編輯于星期三\16點47分教學內(nèi)容1.了解遺傳標記定義、類型、優(yōu)缺點，掌握分子遺傳標記定義、原理和在藥用植物鑒定中的應用。熟悉PCR的原理和步驟。2.掌握常用的分子標記（RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP）原理和方法。3.重點掌握藥用植物分子鑒定的方法和流程（以柴胡為例）。本文檔共94頁；當前第3頁；編輯于星期三\16點47分第一節(jié)遺傳標記（geneticmarker）定義：由一對等位基因差異造成的，能夠明確區(qū)分，遺傳傳遞過程可以跟蹤的相對性狀或生物特征。如形態(tài)上的質(zhì)量性狀：花瓣顏色、種子顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。本文檔共94頁；當前第4頁；編輯于星期三\16點47分1.形態(tài)標記（MorphologicalMarkers）遺傳學上穩(wěn)定、可見的外部特征---遺傳與環(huán)境、結構基因與調(diào)控基因綜合作用的結果，這種標記可以用于研究物種間關系、分類和鑒定。如植株高矮、花瓣顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。優(yōu)點：簡單、直觀缺點：僅對個體性狀的描述，得出的結論不完善；另外數(shù)量性狀易受環(huán)境影響。遺傳標記的類型本文檔共94頁；當前第5頁；編輯于星期三\16點47分孟德爾豌豆雜交試驗所研究的七對性狀

都是典型的形態(tài)學遺傳標記本文檔共94頁；當前第6頁；編輯于星期三\16點47分2.細胞學標記（CytologicalMarkers）染色體數(shù)目變異及結構變異，表現(xiàn)在染色體核型如數(shù)目、大小、著絲點位置變異等。優(yōu)點：直觀、快速而經(jīng)濟缺點：但變異十分有限，當染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。本文檔共94頁；當前第7頁；編輯于星期三\16點47分王喻寧等，2013本文檔共94頁；當前第8頁；編輯于星期三\16點47分3.生化標記（BiochemicalMarkers）生化標記：指把植物體內(nèi)的某些生化性狀作為遺傳標記，如貯藏蛋白、同工酶等。這種標記可用于繪制“指紋圖譜”進行植物系統(tǒng)發(fā)育、親緣關系和種類鑒定研究。同工酶：指夠催化相同的化學反應，但分子結構、理化特性等不同的一組酶。本文檔共94頁；當前第9頁；編輯于星期三\16點47分3.生化標記（BiochemicalMarkers）優(yōu)點：經(jīng)濟、方便、成本較低缺點：結構基因表達產(chǎn)物，對非結構基因無能為力；所檢測位點只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時期和環(huán)境影響。本文檔共94頁；當前第10頁；編輯于星期三\16點47分4.分子標記（molecularmarkers）分子標記是指能夠被檢測出來的DNA序列上的遺傳多態(tài)性（等位差異）。TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG品種1品種2堿基差異長度差異本文檔共94頁；當前第11頁；編輯于星期三\16點47分4.1分子標記的檢測方法兩個步驟：獲得目標DNA片段：酶切，擴增（PCR）檢測不同樣品間目標片段的差異（多態(tài)性）：電泳，分子雜交，DNA芯片（高通量）本文檔共94頁；當前第12頁；編輯于星期三\16點47分TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG電泳方向品種1品種2品種1品種2長度差異片段電泳檢測：本文檔共94頁；當前第13頁；編輯于星期三\16點47分4.2分子標記的特點本質(zhì)是以核苷酸序列作為標記，一般特點：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異；（3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組；（4）多數(shù)分子標記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。本文檔共94頁；當前第14頁；編輯于星期三\16點47分遺傳學上，把共顯性定義為F1代中，雙親的性狀同時表現(xiàn)的現(xiàn)象。共顯性能夠?qū)㈦s合體和純合體從表現(xiàn)上區(qū)分開。共顯性：F1P1F1本文檔共94頁；當前第15頁；編輯于星期三\16點47分通過比較藥用植物種間DNA分子遺傳多樣性差異來鑒別其種類的方法。4.3分子標記的應用：藥用植物分子鑒定狹葉柴胡Bupleurumscorzonerifolium北柴胡BupleurumchinenseChaoetal.2014Phytomedicine

中國柴胡有42種，17變種本文檔共94頁；當前第16頁；編輯于星期三\16點47分DNA分子標記技術直接分析生物的基因型，與上述傳統(tǒng)的方法比較，具有下列優(yōu)點：

遺傳穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每一個體的任一體細胞均含有相同的遺傳信息。因此，用DNA分子特征作為遺傳標記進行物種鑒別更為準確可靠。本文檔共94頁；當前第17頁；編輯于星期三\16點47分

遺傳多樣性：DNA分子是由G、A、C、T四種堿基構成，為雙螺旋結構的長鏈狀分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現(xiàn)在這4種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣性(geneticdiversity)。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來鑒別物種就是DNA分子遺傳標記鑒別(identificationbyDNAmoleculargeneticmarker)。本文檔共94頁；當前第18頁；編輯于星期三\16點47分

化學穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的載體，除具有較高的遺傳穩(wěn)定性外，在諸多的生物大分子中，比蛋白質(zhì)、同功酶等具有較高的化學穩(wěn)定性。不象蛋白質(zhì)和同功酶那樣，在生物體死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陳舊標本中所保存下來的DNA仍能夠用于DNA分子遺傳標記的研究。本文檔共94頁；當前第19頁；編輯于星期三\16點47分4.4分子標記的類型分子標記的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段，也稱為三代DNA分子標記：第一代分子標記（以分子雜交為核心）：RFLP；第二代分子標記（以PCR為核心）：RAPD；AFLP；SSR；ISSR分子標記第三代分子標記（以DNA測序為核心）：單核苷酸多態(tài)性(SNP)；表達序列標簽(EST)；ITS本文檔共94頁；當前第20頁；編輯于星期三\16點47分聚合酶鏈式反應

PolymeraseChainReaction（PCR）PCR定義：是一種模擬體內(nèi)DNA復制過程的體外酶促合成特異性核酸片段的技術。PCR原理：以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物(15-25堿基)介導，通過DNA聚合酶酶促反應，在體外進行特異DNA序列擴增。本文檔共94頁；當前第21頁；編輯于星期三\16點47分PCR三步驟①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右5min，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；本文檔共94頁；當前第22頁；編輯于星期三\16點47分②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；本文檔共94頁；當前第23頁；編輯于星期三\16點47分③引物的延伸：DNA模板－引物結合物于72℃左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。本文檔共94頁；當前第24頁；編輯于星期三\16點47分本文檔共94頁；當前第25頁；編輯于星期三\16點47分

小結與思考小結：1.四種類型遺傳標記中，分子標記具有其他遺傳標記無法比擬的有點，遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性、化學穩(wěn)定性，在藥用植物或生藥鑒定中應用最為廣泛的標記。2.PCR技術是分子標記的基礎，PCR原理和步驟為：變性-退火-延伸。思考：1.分子標記進行藥用植物鑒定依據(jù)的是什么？

2.與三種傳統(tǒng)遺傳標記相比，分子標記優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？

3.理解PCR的原理和步驟。本文檔共94頁；當前第26頁；編輯于星期三\16點47分

參考書及相關文獻資料參考書：1.《中藥生物工程》,主編:高文遠,上?？茖W技術出版社.2《中藥現(xiàn)代生物技術》,主編:胡之璧,人民衛(wèi)生出版社.3.《中藥生物技術》,主編:賈景明,化學工業(yè)出版社.參考文獻：1.徐紅,王崢濤,胡之璧.中藥DNA分子鑒定技術的發(fā)展與應用[J].中藥現(xiàn)代化,2003,5(2):24-30.2.

海學忠.DNA分子標記在中藥鑒定中的應用進展[J].中外健康文摘,2012,9(35):442-446.3.陳士林,郭寶林,張貴君等.中藥鑒定學新技術新方法研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(8):1043-1055.本文檔共94頁；當前第27頁；編輯于星期三\16點47分第二節(jié)常用的分子標記本文檔共94頁；當前第28頁；編輯于星期三\16點47分1.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）RFLP原理：基因組DNA經(jīng)限制酶切，可產(chǎn)生大量長短不一的片段。通過電泳可以將這些片段分離開。片段長的遷移速度慢，短的遷移速度快。如果一對等位基因（序列）的限制酶切片段長度不同，則稱為RFLP。以標有放射性同位素或化學標記物質(zhì)、來自特定基因座的DNA片段為探針，可以檢驗該座位是否存在多態(tài)性。本文檔共94頁；當前第29頁；編輯于星期三\16點47分RFLP原理示意圖左邊：等位序列酶切電泳的結果右邊：用探針檢驗的結果。本文檔共94頁；當前第30頁；編輯于星期三\16點47分1.1產(chǎn)生RFLP的原因點突變：單個堿基的改變（轉(zhuǎn)換或顛換），造成失去某個酶切位點或產(chǎn)生一個新的酶切位點，使突變型酶切片段變長或變短。插入突變：使突變型酶切片段變長。缺失突變：使突變型酶切片段變短。本文檔共94頁；當前第31頁；編輯于星期三\16點47分1.2RFLP的檢測方法酶切電泳Southern雜交放射自顯影本文檔共94頁；當前第32頁；編輯于星期三\16點47分結核分枝桿菌基因組RFLP圖譜本文檔共94頁；當前第33頁；編輯于星期三\16點47分RFLP的優(yōu)點標記廣泛存在于生物體內(nèi)，不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。RFLP標記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區(qū)分純合基因與雜合基因?？僧a(chǎn)生的標記數(shù)目很多，可覆蓋整個基因組。本文檔共94頁；當前第34頁；編輯于星期三\16點47分RFLP的缺點標記技術需要酶切，對DNA質(zhì)量要求高；RFLP的多態(tài)性程度偏低；分子雜交時會用到放射性同位素，對人體和環(huán)境都有害；探針的制備、保存和發(fā)放也很不方便；分析程序復雜、技術難度大、費時、成本高。本文檔共94頁；當前第35頁；編輯于星期三\16點47分1.3RFLP的應用1.遺傳學圖的構建結合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交，快速有效地進行轉(zhuǎn)移。2.基因定位利用RFLP技術能夠準確地標記定位種質(zhì)中的目標基因，結合雜交，回交及組織培養(yǎng)等技術就可以快速有效的將所需目標基因的DNA片段引入栽培品種中，實現(xiàn)品種改良。本文檔共94頁；當前第36頁；編輯于星期三\16點47分3.遺傳多態(tài)性分析運用RFLP技術可以盡可能多地保存那些在已知位點上有異態(tài)的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細胞質(zhì)遺傳研究RFLP技術是對DNA序列自然變異的直接檢測，只需選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶或DNA探針作分子標記，因而對植物不同種屬或雜種后的細胞質(zhì)遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應用于細胞質(zhì)遺傳的研究。本文檔共94頁；當前第37頁；編輯于星期三\16點47分2.隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）RAPD原理：建立于PCR基礎之上，使用一系列具有10個左右堿基的單鏈隨機引物，以較低的退火溫度（36℃），對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測多態(tài)性。由于整個基因組存在眾多反向重復序列，因此須對每一隨機引物單獨進行PCR。單一引物與反向重復序列結合，使重復序列之間的區(qū)域得以擴增。本文檔共94頁；當前第38頁；編輯于星期三\16點47分

引物結合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導致擴增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB(溴化乙錠)染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。本文檔共94頁；當前第39頁；編輯于星期三\16點47分RAPD原理示意圖本文檔共94頁；當前第40頁；編輯于星期三\16點47分本文檔共94頁；當前第41頁；編輯于星期三\16點47分OPA1:5’-CAGGCCCTTC-3’OPD11:5’-AGCGCCATTG-3’OPD8:5’-GTGTGCCCCA-3’OPD11OPD8OPA11北柴胡(陜西)

2北柴胡(河北)

3竹葉柴胡4大葉柴胡5小葉黑柴胡6狹葉柴胡MMarkerRAPD的應用-分類鑒定本文檔共94頁；當前第42頁；編輯于星期三\16點47分RAPDanalysisof27saffloweraccessionsfromeightdifferentgeographicalregionswithOperonprimerAA-04.AA-04producedsevenpolymorphicbands本文檔共94頁；當前第43頁；編輯于星期三\16點47分Lanes1and26:ladder1Kb;Lanes2to27:melon.Arrowsindicatepolymorphicmarkersusedforanalysis.本文檔共94頁；當前第44頁；編輯于星期三\16點47分RAPD的優(yōu)點：技術簡單，實驗周期短，信息量大，檢測速度快；DNA用量少；實驗設備簡單，不需DNA探針，設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析；不依賴于種屬特異性和基因組的結構，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個引物就可擴增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組，而且不需要同位素，安全性好。本文檔共94頁；當前第45頁；編輯于星期三\16點47分RAPD缺點：顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；RAPD對反應條件相當敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實驗的穩(wěn)定性和重復性差。本文檔共94頁；當前第46頁；編輯于星期三\16點47分在RAPD和RFLP技術基礎上建立了SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregions，序列特異性擴增區(qū)域)，CPAS(Cleavedpolymorphicamplifiedsequence，酶切擴增多態(tài)序列)和DAF(DNAamplifiedfingerprints，DNA擴增指紋)等標記技術。這些技術的出現(xiàn)，進一步豐富和完善了第一代分子標記，增加了DNA多態(tài)性的研究手段。本文檔共94頁；當前第47頁；編輯于星期三\16點47分3.SSR標記技術SSR原理：在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列，如重復單位長度在15～65個核苷酸的小衛(wèi)星DNA，重復單位長度在2～6個核苷酸的微衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位點。由于重復單位的大小和序列不同以及拷貝數(shù)不同,從而構成豐富的長度多態(tài)性。本文檔共94頁；當前第48頁；編輯于星期三\16點47分

定義：SSR（全稱為簡單序列長度多態(tài)性標記）也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復，即(CA)n和(TG)n，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結構相同，重復單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。本文檔共94頁；當前第49頁；編輯于星期三\16點47分根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復數(shù)目不同，因而擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標記。本文檔共94頁；當前第50頁；編輯于星期三\16點47分SSR原理示意圖SSR：以2－6個堿基為單位的短重復序列CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCCGTACATCAGATAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTC......CGTACATCAGATAG上游引物下游引物SSR長度（重復數(shù)）容易產(chǎn)生變異相對保守相對保守本文檔共94頁；當前第51頁；編輯于星期三\16點47分SSR的檢測本文檔共94頁；當前第52頁；編輯于星期三\16點47分SSR標記的優(yōu)點在基因組中數(shù)量豐富，分布較均勻存在復等位基因，多態(tài)性水平較高一般表現(xiàn)為共顯性，信息完整基于PCR技術，簡單方便SSR標記的缺點開發(fā)成本高，需知道基因組序列，只有全基因組已完成測序的植物才能方便地開發(fā)。本文檔共94頁；當前第53頁；編輯于星期三\16點47分4.ISSR（SSR間區(qū)）在SSR序列上設計引物PCR檢測相鄰SSR位點之間區(qū)段的長度多態(tài)性穩(wěn)定性比RAPD好SSRSSR上游引物下游引物本文檔共94頁；當前第54頁；編輯于星期三\16點47分SNP原理：SNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化。

主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5.單核苷酸多態(tài)性標記(SNP)本文檔共94頁；當前第55頁；編輯于星期三\16點47分單核苷酸多態(tài)性（SNP）

數(shù)量非常豐富，有廣闊應用前景?！瑿AAGATCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG…||||||||||||||||||||||||||||||||||||…CAAGACCTTGGAGACTAACTATAG.....GCGTACATCGGATAG…SNP本文檔共94頁；當前第56頁；編輯于星期三\16點47分檢測SNP基因型的生化原理本文檔共94頁；當前第57頁；編輯于星期三\16點47分SNP的特點：

SNP與RFLP及SSR標記的不同有2個方面：其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記；其二，SNP標記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術。對成千上萬個克隆測序，用計算機分析數(shù)據(jù)和顯示最終結果。本文檔共94頁；當前第58頁；編輯于星期三\16點47分檢測：

DNA芯片技術，最新報道的微芯片電泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP。雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價固定在載體表面，用熒光標記引物擴增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號，并行讀取芯片上不同SNP熒光信號，獲得SNP信息。本文檔共94頁；當前第59頁；編輯于星期三\16點47分SNP的優(yōu)點

數(shù)量多，分布廣泛，檢測快速、易于實現(xiàn)自動化，遺傳穩(wěn)定性高。SNP的缺點成本高，錯誤信號多。本文檔共94頁；當前第60頁；編輯于星期三\16點47分SNP標記的應用

種群生物學特征、遺傳性疾病檢測、疾病關聯(lián)分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數(shù)量性狀定位等方面也有越來越多的應用。本文檔共94頁；當前第61頁；編輯于星期三\16點47分第三節(jié)藥用植物的分子鑒定流程（實例）本文檔共94頁；當前第62頁；編輯于星期三\16點47分

DNA測序法（DNASequencing）目前用于DNA測序的基因主要有：1.有葉綠體基因組的rbcL、matK；2.核基因組的rRNA、ITS等(植物類)；3.線粒體基因組的cty-b(動物類)。本文檔共94頁；當前第63頁；編輯于星期三\16點47分rbcL：基因分辨率高，變異較均一分布，進化速率差異大，一般用于科級以上分類群研究。matK：位于trnK基因的內(nèi)含子中，長約1500堿基，編碼成熟酶并參與RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子的剪切，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進化速率最快的基因之一，變異較均一，一般用于種一級分類群親緣關系研究。本文檔共94頁；當前第64頁；編輯于星期三\16點47分rRNA是編碼核糖體DNA的基因，在植物中以重復連續(xù)排列方式存在，包含進化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)和轉(zhuǎn)錄區(qū)，可選擇較保守的片斷如18S、5S的rRNA進行各種親緣關系研究。本文檔共94頁；當前第65頁；編輯于星期三\16點47分

1.串聯(lián)重復序列，拷貝可達500~40000；不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致。核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS本文檔共94頁；當前第66頁；編輯于星期三\16點47分

2.序列短，具有長度保守性(ITS1:187-298bp，ITS2:187-252bp)核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS本文檔共94頁；當前第67頁；編輯于星期三\16點47分

3.核苷酸序列的高度變異性(每個區(qū)成對序列趨異百分率在4~10%)

4.兩側都有高度保守的序列本文檔共94頁；當前第68頁；編輯于星期三\16點47分材料與方法收集中國境內(nèi)柴胡標本29種36份，基本涵蓋民間入藥的所有品種。名稱憑證標本采集時間采集地點多枝柴胡B.polyclonum謝暉0405170012004年5月云南會澤川滇柴胡B.candollei謝暉0405170022004年5月云南會澤柴胡（栽培）B.chinense晁志、張道廣03080162003年8月陜西鎮(zhèn)巴小柴胡B.hamiltonii晁志、張道廣03080012003年8月云南昆明狹葉柴胡（紅柴胡）B.scorzonerifolium晁志、張道廣03070012003年7月安徽肥東空心柴胡B.longicaulevar.franchetii晁志、張道廣03080112003年8月陜西鎮(zhèn)巴本文檔共94頁；當前第69頁；編輯于星期三\16點47分竹葉柴胡B.marginatum晁志、張道廣03080022003年8月云南昆明抱莖柴胡B.longicaulevar.mplexicaule晁志、張道廣03080032003年8月云南昆明麗江柴胡B.rockii晁志、張道廣03080092003年8月云南麗江柴胡(野生)B.chinense晁志、張道廣03080202003年8月陜西鎮(zhèn)巴汶川柴胡（馬尾柴胡）B.wenchuanense晁志、張道廣03080512003年8月四川汶川馬爾康柴胡B.malconense晁志、張道廣03080532003年8月四川汶川柴首B.chaishoui晁志、張道廣03080542003年8月四川汶川四川柴胡B.sichuanense晁志、張道廣03080522003年8月四川汶川南方大葉柴胡B.longiradiatumf.australe晁志、張道廣03070032003年7月安徽黃山韭葉柴胡B.kunmingense潘勝利03871981年8月云南昆明本文檔共94頁；當前第70頁；編輯于星期三\16點47分窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum潘勝利05061993年7月云南昆明線葉柴胡B.angustissimum潘勝利05161993年8月寧夏同心矮小柴胡B.hamiltoniivar.humile潘勝利03201980年8月云南麗江大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum潘勝利04601986年8月黑龍江尚志煙臺柴胡B.chinensef.vanheurckii潘勝利04991992年8月山東青島瀘西柴胡B.luxiense潘勝利04141983年8月云南建水長白柴胡B.komarovianum潘勝利04701986年8月吉林長白山大苞柴胡B.euphorbioides潘勝利04681986年8月吉林長白山大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum王峻03090012003年9月黑龍江細莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum晁志、張道廣03080102003年8月云南麗江本文檔共94頁；當前第71頁；編輯于星期三\16點47分北柴胡B.chinense晁志、張道廣03000012003年8月陜西太白山窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum晁志、張道廣03080552003年8月甘肅柴胡B.gansuense潘勝利05131993年8月甘肅榆中縣柴胡（栽培）B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407210012004年7月甘肅小隴山柴胡B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407240012004年7月甘肅天水黑柴胡B.smithii謝暉0407270012004年7月甘肅榆中黃花鴨趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorum謝暉0407280012004年7月甘肅榆中興安柴胡B.sibiricum潘勝利05191993年8月內(nèi)蒙古大青山銀州柴胡B.yinchowense謝暉、劉峰林、徐志斌0407230012004年7月甘肅小隴山小柴胡B.hamiltonii徐士奎04080012004年8月川滇交界本文檔共94頁；當前第72頁；編輯于星期三\16點47分基因組DNA提?。悍謩e使用CTAB法和植物基因組小量抽提試劑盒提取植物基因組DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。-20℃冰箱保存，備用。材料與方法本文檔共94頁；當前第73頁；編輯于星期三\16點47分

ITS序列擴增：ITS序列采用5P、4P雙引物進行擴增，引物序列分別為：“ITS5P”-5’>GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG<3’，“ITS4P”-5’>TCCTCCGCTTATTGATATGC<3’。

反應體系(50μL)：10×PCR發(fā)應緩沖液5.0μL，dNTP(2.5mmol/Leach)3.0μL,Taq酶1U，引物(10μmol/L)各5.0μL，模板1-5μL。本文檔共94頁；當前第74頁；編輯于星期三\16點47分反應程序：93℃5min，55℃2min；93℃30s，55℃45s，70℃45s，循環(huán)35次；70℃5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒對目標條帶進行純化，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，備用。本文檔共94頁；當前第75頁；編輯于星期三\16點47分單克隆挑選與測序膠回收純化后的ITS序列直接測序，部分結果有雙峰出現(xiàn)。此結果可能與多拷貝在進化過程中尚未形成完全一致的序列有關，因此通過使用T載體，隨機挑取單克隆測序以獲得樣品ITS序列。本文檔共94頁；當前第76頁；編輯于星期三\16點47分序列分析：1.

ClustalX軟件進行進行比對，選擇一條嚴格一致序列作為該樣本的代表序列，并于Genbank登陸。2.使用DNAssist2.2軟件對本研究中獲得的序列進行兩兩比對，并計算同源性。同時所獲得序列與外類群序列進行兩兩比對，計算同源性。本文檔共94頁；當前第77頁；編輯于星期三\16點47分結果：圖1.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑盒提取所得植物基因組DNA。圖中標號為樣品編號。60ng－15ng為不同量的λDNA上樣，其分子量為48kb，用以標示完整植物基因組的大小，同時對獲得的DNA樣本半定量，上樣體積均為5μL。本文檔共94頁；當前第78頁；編輯于星期三\16點47分圖2.1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本ITS序列擴增結果。M標示分子量MarkerL2000，數(shù)字標號為樣品編號。PCR產(chǎn)物及其左側分子量Marker為同塊膠電泳檢測，每組PCR反應均設有陰性對照，結果均為陰性。上樣量5μL。結果：本文檔共94頁；當前第79頁；編輯于星期三\16點47分圖3.1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本PCR擴增產(chǎn)物目標條純化結果。M標示分子量MarkerDL2000，數(shù)字標號為樣品編號。結果：本文檔共94頁；當前第80頁；編輯于星期三\16點47分圖4.1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測6號、9號DNA樣本PCR產(chǎn)物純化后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10細胞結果。結果：本文檔共94頁；當前第81頁；編輯于星期三\16點47分結果：36份樣品中共獲得27條ITS序列的嚴格一致序列名稱序列編號Genebank登錄號多枝柴胡B.polyclonumY1DQ285463川滇柴胡B.candolleiY2DQ285471柴胡（栽培）B.chinenseS1DQ285452小柴胡B.hamiltoniiY3DQ285472狹葉柴胡（紅柴胡）B.scorzonerifoliumO1DQ285465空心柴胡B.longicaulevar.franchetiiS2DQ285453本文檔共94頁；當前第82頁；編輯于星期三\16點47分竹葉柴胡B.marginatumY4DQ285467抱莖柴胡B.longicaulevar.amplexicauleY5DQ285469麗江柴胡B.rockiiY6DQ285458柴胡(野生)B.chinenseS3DQ285449汶川柴胡（馬尾柴胡）B.wenchuanenseC1DQ285461馬爾康柴胡B.malconenseC2DQ285446柴首B.chaishouiC3DQ285462四川柴胡B.sichuanenseC4DQ285447南方大葉柴胡B.longiradiatumf.australeA1DQ285460窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllumY7DQ285468本文檔共94頁；當前第83頁；編輯于星期三\16點47分線葉柴胡B.angustissimumN1DQ285464細莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerumY8DQ285459柴胡B.chinenseS4DQ285450窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllumO2DQ285466柴胡（栽培）B.chinenseG2DQ285448柴胡B.chinenseG3DQ285451黑柴胡B.smithiiG4DQ285455黃花鴨趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorumG5DQ285456興安柴胡B.sibiricumM1DQ285457銀州柴胡B.yinchowenseG6DQ285454小柴胡B.hamiltoniiO3DQ285470本文檔共94頁；當前第84頁；編輯于星期三\16點47分A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8A1南方大葉柴胡Y1多枝柴胡97.37Y2川滇柴胡90.9090.31Y3小柴胡90.4189.9898.84Y4竹葉柴胡89.9289.8293.7193.21Y5抱莖柴胡89.4189.6694.3794.0495.52Y6麗江柴胡97.8596.7290.1089.6089.4489.27Y7窄竹葉柴胡87.9387.3692.5592.0696.8594.3687.62Y8細莖有柄柴胡97.3796.2289.6489.1488.9888.8299.5187.17G2柴胡（栽培）96.5395.8990.5690.0189.2489.4096.3787.4295.72ITS序列比對結果ResultsofthehomologousalignmentofITSsequences本文檔共94頁；當前第85頁；編輯于星期三\16點47分A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8G2G3G4G5G6C1C2C3C4M1G3柴胡95.3794.9189.5989.0988.7888.1095.7187.1195.2397.52G4黑柴胡98.0297.2190.4389.6089.9389.9397.8588.1297.3796.5395.71G5黃花鴨趾柴胡98.1897.3790.5990.1090.1090.1098.0288.2897.5396.7095.8799.83G6銀州柴胡96.6996.8890.9190.4189.9289.9297.6988.1097.2098.5197.6997.6997.85C1汶川柴胡97.0397.5489.6489.6289.1389.1396.5487.4896.0595.5594.7397.0397.2096.71C2馬爾康柴胡96.0395.4090.2389.7489.0789.0795.8787.0995.3999.6797.1996.2096.3798.1895.22C3柴首97.0397.7089.4689.4688.9689.1396.5487.1596.0595.5594.7397.0397.2096.7098.8595.22C4四川柴胡96.0395.7390.2589.7589.2689.2695.8787.2795.5699.6797.1996.2096.3798.1895.3999.3395.39M1興安柴胡98.1897.3790.5990.1090.1090.1098.0288.2897.5396.7095.8799.8399.8397.8597.2096.3797.2096.37O1狹葉柴胡97.8597.2190.7490.2590.2589.9297.3688.4396.8896.3695.8797.8598.0297.5296.8796.0397.3696.2098.51ITS序列比對結果ResultsofthehomologousalignmentofITSsequences本文檔共94頁；當前第86頁；編輯于星期三\16點47分A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8G2G3G4G5G6C1C2C3C4M1O1O2O3N1S1S2S3S4O2窄竹葉柴胡89.4288.6793.7193.2199.5095.3688.9496.8588.4988.9188.6089.4489.6089.4288.6388.5888.4788.7889.6089.75O3小柴胡90.4190.3199.5099.0194.0494.5490.2692.8889.8090.7389.7590.5990.7691.0789.7990.4089.6290.4190.7690.9093.87N1線葉柴胡97.8597.0490.7690.2690.2690.1097.3688.7896.8896.3795.8797.8598.0297.5296.8796.0496.8796.0498.0299.0089.7790.92S1柴胡（栽培）96.3895.8989.7989.2989.2988.8096.8787.4896.2297.3697.8696.7196.8797.6995.5597.0395.7297.0396.8796.7188.9689.9596.71S2空心柴胡96.3696.2289.5789.0789.0788.9196.3787.5896.0597.5296.6996.8697.0397.6995.7297.1995.7297.0297.0396.5388.7489.7496.5397.53S3柴胡（野生）96.5395.8990.7390.2389.4089.5796.3787.5895.8999.1797.6996.7096.8698.6895.7298.8495.7298.8496.8696.5389.0790.8996.5397.5397.68S4柴胡96.3695.3790.5690.0789.2289.3996.2087.4095.8999.0197.5296.5396.7098.5195.7298.6896.0598.6896.7096.8688.8990.7396.3797.3697.5299.50Carumcarvi71.5771.5070.0271.3671.9771.7171.9570.1571.7171.8572.4071.7871.9571.9071.2971.5270.7971.5771.9572.4071.8171.8572.2872.6572.3572.5271.97Conioselinumchinense73.2273.0773.8473.6872.6473.0973.6070.7873.1973.6873.5573.4373.6073.7272.9873.3473.1573.3973.6074.2172.4774.0173.6073.3173.6873.8474.30Oenanthejavanica71.0769.6271.0371.0370.8170.0070.9668.8270.5670.3670.5870.4170.6370.9169.3670.3669.1970.0870.6370.9170.1571.1970.3070.3570.1570.7070.78Laserpitiumhispidum69.0968.9769.0469.7067.6667.5070.1366.8369.9068.8769.0969.4769.6469.4268.7068.5469.1968.6069.64