多糖類藥物的分析

第一節(jié)概述1．從動物來源的多糖。2．從微生物來源的多糖。3．從植物來源的多糖。4.從海洋生物來源的多糖。

1本文檔共55頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\2點59分組成分類：均一多糖不均一多糖:不同類型的單糖縮合而成粘多糖：含氮的不均一多糖結(jié)合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖糖蛋白通過糖肽鍵(carbohydrate-peptidelinkage)將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來,連接方式主要分為β-構(gòu)型的N-糖苷鍵和α-構(gòu)型的O-糖苷鍵.2本文檔共55頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\2點59分糖蛋白有三種主要類型糖蛋白分為三種主要類型：O-糖苷鍵型糖蛋白、N-糖苷鍵型糖蛋白和連有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。在大多數(shù)的O-糖苷鍵型糖蛋白中，GalNAc殘基通過O-糖苷鍵與一個絲氨酸或蘇氨酸殘基連接形成，縮寫為GalNAc-Ser/Thr。在N-糖苷鍵型糖蛋白中，GlcNAc殘基通過N-糖苷鍵與一個天冬酰胺殘基相連，縮寫為GlcNAc-Asn。3本文檔共55頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\2點59分O-糖苷鍵N-糖苷鍵O-（N-）糖苷鍵型糖蛋白4本文檔共55頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\2點59分磷酸乙醇胺殘基磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白5本文檔共55頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\2點59分蛋白聚糖

軟骨蛋白聚糖:聚集體的分子量非常大（大約為2×108），其中含有透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素、連接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖鏈。6本文檔共55頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\2點59分六員環(huán)糖類似于吡喃，所以又稱之為吡喃糖，而五員環(huán)糖類似于呋喃，稱之為呋喃糖。環(huán)化單糖中氧化數(shù)最高的碳稱為異頭碳。在環(huán)式結(jié)構(gòu)中，異頭碳是手性碳，所以環(huán)化的醛糖或酮糖可以呈現(xiàn)兩種異頭構(gòu)型中的一種，即-或-構(gòu)型。

吡喃呋喃多糖組成-單糖7本文檔共55頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\2點59分葡萄糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)8本文檔共55頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\2點59分椅式構(gòu)象β-D-葡萄糖α-D-葡萄糖

9本文檔共55頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\2點59分直鏈淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷鍵結(jié)合成的鏈狀化合物

直鏈淀粉10本文檔共55頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\2點59分纖維素11本文檔共55頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\2點59分多糖的理化性質(zhì)旋光性硫酸蒽酮反應(yīng)（620nm）硫酸苯酚反應(yīng)(490nm)氨基己糖——乙酰丙酮(525nm)糖醛酸——硫酸咔唑(520nm)12本文檔共55頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\2點59分第二節(jié)多糖的純度測定

（一）超離心法（二）電泳法（三）凝膠色譜法（四）旋光法13本文檔共55頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\2點59分第三節(jié)多糖的分子量測定

凝膠色譜法粘度法超離心法高效液相色譜14本文檔共55頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\2點59分凝膠層析法凝膠層析法：將分子量不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。Kd=0，Ve=

V0；Kd=1，Ve=V0+Vi；0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi。15本文檔共55頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\2點59分凝膠色譜法方法：SephadexG-200，多糖標(biāo)準(zhǔn)品分部收集，硫酸-苯酚檢測，分別求得洗脫體積Ve，Ve與1gM之間存在著線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ve=-KlogM+C將待測樣品上柱，待測多糖Ve。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測多糖分子量。16本文檔共55頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\2點59分粘度法、超離心法粘度法：用已知結(jié)構(gòu)相似的多糖決定K值（η＝KM2），然后測出待測多糖的特性粘數(shù)η，計算待測多糖的分子量。超離心法：根據(jù)測得的沉降系數(shù)計算多糖的平均分子量。17本文檔共55頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\2點59分高效液相色譜法測定分子量及分布色譜條件：凝膠柱（分子量大小），示差折光檢測器。標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogMW=a+btRMW為重均分子量，tR為保留時間待測多糖分子量（GPC專用軟件）：重均分子量Mw=∑(RIiMi)/∑RIiMi為供試品在保留時間ti時的分子量，RIi在第i部分中被洗脫物質(zhì)的量（重量）。

18本文檔共55頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\2點59分第四節(jié)、多糖的含量測定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）生物測定法（肝素鈉）生色底物法（低分子量肝素鈉）19本文檔共55頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\2點59分乙酰丙酮法（elson-morgan）

——氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對－二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈紅色，于525nm測定吸收度。20本文檔共55頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\2點59分硫酸咔唑法測糖含量硫酸咔唑法—己糖醛酸測定在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應(yīng)生成的反應(yīng)物呈紅色。

520nm比色21本文檔共55頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\2點59分硫酸苯酚法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強酸性條件下，與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物。它在490nm處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關(guān)系。22本文檔共55頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\2點59分蒽酮法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進(jìn)一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，620nm進(jìn)行比色測定。特點：10-100μg范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖含量成正比。靈敏度高。23本文檔共55頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\2點59分生物測定法－肝素測定美國藥典采用羊血漿法。即比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品延長血漿凝結(jié)時間的作用來測定肝素的效價。24本文檔共55頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\2點59分生物測定法——肝素測定方法標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組（

ds1、ds2、ds3）用0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值為1:0.7。供試品稀釋液的配制：按供試品的標(biāo)示量或估計效價（AT），照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低（

dT1、dT2、dT3）三種濃度的稀釋液。各管凝結(jié)時間換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中的量反應(yīng)平行線測定法計算效價及實驗誤差?？尚畔蘼剩‵L%）不得大于5%。25本文檔共55頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\2點59分生色底物法原理－肝素、低分子肝素

當(dāng)?shù)鞍酌福‵Ⅹa）從生色底物分裂出pNA時，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價成反比。405nm測定。26本文檔共55頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\2點59分生色底物Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰，

Tos：甲苯磺酰；對-硝基苯胺（pNA）。酰胺分解法（amidolyticmethod）。當(dāng)?shù)鞍酌笍纳孜锓至殉鰌NA時，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價成反比。。405nm測定。27本文檔共55頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\2點59分生色底物法

抗Xa因子活性測定

以溶液吸收度和濃度的對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中量反應(yīng)平行線測定法計算出供試品的抗Xa因子活性

可信限率(FL%)不得大于10%。

28本文檔共55頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\2點59分第五節(jié)、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析單糖組成糖苷鍵連接方式糖苷鍵連接位置29本文檔共55頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\2點59分（一）多糖組成單糖的分析1、水解方法（1）、完全酸水解法（2）、部分酸水解、堿水解（3）、乙酰解（4）、甲醇解（5）、酶降解2、鑒定30本文檔共55頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\2點59分（1）、完全酸水解法

水解難易取決單糖性質(zhì)及構(gòu)型。呋喃型戊聚糖較吡喃型己聚糖易水解，α型較β型易水解。已聚糖一般用1mol/L硫酸，70℃，8小時。氨基葡聚糖為4mol/L鹽酸，100℃9小時。31本文檔共55頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\2點59分

（2）、部分酸水解、堿水解選擇溫和的條件水解多糖，使糖鏈中某種類型的鍵特異性地打斷。（3）、乙酰解多糖經(jīng)過乙酰解反應(yīng)（醋酐、冰醋酸）可生成乙酰化單糖和寡糖32本文檔共55頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\2點59分（4）、甲醇解多糖鏈在80－100℃條件下與無水甲醇反應(yīng)能將糖鏈變成組成單糖的甲基糖苷。甲基糖苷能轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚衍生物或乙?；苌?，進(jìn)行氣相色譜分析。33本文檔共55頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\2點59分（5）、酶降解分為外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶。外切糖苷酶：切下多糖非還原末端的一個單糖，并對單糖組成和糖苷鍵有專一性要求。內(nèi)切糖苷酶可水解糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵，釋放多糖鏈片斷以利于結(jié)構(gòu)分析。34本文檔共55頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期六\2點59分2、單糖的分離鑒定氣相色譜法高效液相色譜法氣相色譜法與質(zhì)譜分析連用35本文檔共55頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期六\2點59分氣相色譜法常用的衍生物有：

三甲硅烷（TMS）衍生物三氟乙酰（TEA）衍生物乙酰（AC）衍生物甲基（Me）衍生物36本文檔共55頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期六\2點59分二、糖苷鍵連接方式的測定紅外光譜——糖苷鍵類型確定吡喃糖糖苷鍵時，用紅外光譜，在890cm-1處有特征吸收者，示有β-型糖苷鍵，在840cm-1處有特征吸收者，示有α-型糖苷鍵。核磁共振譜——糖苷鍵（α型或β型）。H-NMR譜中的化學(xué)位移δ5.4和δ5.1，有兩個信號說明分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵為α型，如有δ4.53說明有β型。37本文檔共55頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期六\2點59分三、糖苷鍵連接位置的測定（一）、高碘酸氧化、Smith降解（二）、甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析（三）、乙酰解后質(zhì)譜分析38本文檔共55頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期六\2點59分（一）高碘酸氧化、Smith降解原理：選擇性的氧化降解反應(yīng)，能夠作用于多糖分子中1，2—二羥基和1，2，3—三羥基，生成過碘酸氧化產(chǎn)物；此產(chǎn)物用硼氫化鈉還原后，再用酸水解，生成相應(yīng)的醛、甲酸。室溫下用稀無機酸水解還原產(chǎn)物。39本文檔共55頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期六\2點59分1，2連接的糖苷鍵1，2連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及甘油醛。方程式：40本文檔共55頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期六\2點59分1，3連接的糖苷鍵1，3連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應(yīng)，經(jīng)還原與水解后得到原來的單糖。方程式：41本文檔共55頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期六\2點59分1，4連接的糖苷鍵1，4連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。42本文檔共55頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期六\2點59分1，6連接的糖苷鍵1，6連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。43本文檔共55頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期六\2點59分（二）甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以氣相色譜鑒定甲基化水解產(chǎn)物。如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成二甲基單糖。44本文檔共55頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期六\2點59分（三）乙?；筚|(zhì)譜分析原理：多糖經(jīng)過乙酰化反應(yīng)（醋酐、冰醋酸）生成乙酰化單糖和寡糖。用氯仿抽提，蒸去氯仿，進(jìn)行質(zhì)譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結(jié)構(gòu)。45本文檔共55頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期六\2點59分實例：右旋糖酐（dextran）右旋糖酐，又稱葡聚糖，是若干個葡萄糖脫水形成的聚合物。微生物多糖，也是第一個工業(yè)化的微生物多糖，是由腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）發(fā)酵產(chǎn)生的。產(chǎn)物的分子量很大，經(jīng)水解后，用不同濃度乙醇多定分級沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。臨床上使用的是平均分子量為16000~24000，32000~42000和64000~76000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它們均是用做代血漿。46本文檔共55頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期六\2點59分一、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)右旋糖酐的結(jié)構(gòu)：它主要由葡萄糖（1→6）α-糖苷鍵連接而成，同時含有(1→3)α-和(1→4)α-糖苷鍵連接形成的分支結(jié)構(gòu)。右旋糖酐為白色無定形粉末，無臭、無味，易溶于熱水。右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的膠體溶液，在乙醇等有機溶劑中不溶。47本文檔共55頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期六\2點59分二、鑒別右旋糖酐經(jīng)堿性水解后產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+還原為紅色氧化亞銅沉淀。操作方法：取本品0.2g，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液2ml與硫酸銅試液數(shù)滴，加熱后變成紅棕色沉淀

。48本文檔共55頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期六\2點59分三、檢查右旋糖酐的檢查項目較多，其中氯化物、重金屬、干燥失重、熾灼殘渣的檢查參見中國藥典2000年版二部附錄，此外還有氮、分子量與分子量分布的檢查。氮:用發(fā)酵法制備右旋糖酐時，發(fā)酵濾液中存在著微量蛋白質(zhì)。49本文檔共55頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期六\2點59分氮取本品0.2g，置50ml凱氏燒瓶中，加硫酸1ml，加熱消化至供試品成黑色油狀物，放冷，加30%過氧化氫溶液2ml，加熱消化至溶液澄清，冷卻至20℃以下，加水10ml，滴加管中，再用水稀釋至刻度，緩緩加堿性碘化