第九章 細(xì)胞培養(yǎng)

第九章細(xì)胞培養(yǎng)第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四9.2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)9.1單細(xì)胞的分離9.3單細(xì)胞培養(yǎng)主要內(nèi)容第二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四植物細(xì)胞培養(yǎng)是指對(duì)植物器官或愈傷組織上分離出的單細(xì)胞（或小細(xì)胞團(tuán)）進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)胞無性系或再生植株的技術(shù)。第三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四9.1單細(xì)胞的分離

◆單細(xì)胞的分離方法：

（1）機(jī)械法：分離葉肉細(xì)胞是先把葉片輕輕研碎再通過過濾和離心氧化細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：1.細(xì)胞不會(huì)受到酶的傷害。

2.不需質(zhì)壁分離，有利于進(jìn)行生理和生化研究缺點(diǎn)：容易傷害細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四（2）酶解法：利用果膠酶、纖維素酶處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞，該法不僅能降解中膠層，而且還能軟化細(xì)胞壁。因此，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)。第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四◆從愈傷組織分離單細(xì)胞表面消毒的器室上切取組織—（接種）滲透培養(yǎng)基上—產(chǎn)生愈傷組織——?jiǎng)兿隆ǚ磸?fù)繼代）—愈傷組織的松散性（不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長(zhǎng)速度，結(jié)構(gòu)可松散性）—單細(xì)胞（或很小的細(xì)胞團(tuán)）。第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四首先形成愈傷組織，將未分化和易粉碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移到盛有液體培養(yǎng)基（愈傷組織放在較高鹽分，高生長(zhǎng)素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后移入液體培養(yǎng)基中并攪拌而分散成單細(xì)胞）的容器中，置于搖床上不斷振蕩。通過振蕩對(duì)細(xì)胞團(tuán)施以一種緩和的壓力，使它們破壞成小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞，保持均勻分布在培養(yǎng)基中。有利促進(jìn)培養(yǎng)基和容器內(nèi)空氣之間的氣體交換。第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四◆植物單細(xì)胞培養(yǎng)的意義1、建立單細(xì)胞無性系2、采用生物化學(xué)的方法，對(duì)培養(yǎng)的單細(xì)胞進(jìn)行人工誘發(fā)突變3、排除體細(xì)胞干擾4、遺傳轉(zhuǎn)化受體的建立第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四

9.2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

◆概念：用液體培養(yǎng)基對(duì)保持良好的分散狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體于搖床上進(jìn)行培養(yǎng)的方法，稱為cellsuspensionculture。第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四SFY—XSFY—X系列全自動(dòng)動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵罐第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四◆培養(yǎng)類型

分批培養(yǎng)（BatcnCulture）連續(xù)培養(yǎng)（ContinuousCulture）

第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四分批培養(yǎng)：指細(xì)胞在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，目的是建立單細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)過程中，除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)即行停止。為了使分化培養(yǎng)的細(xì)胞不斷增殖，必須進(jìn)行繼代培養(yǎng)，方法是取出培養(yǎng)瓶中的一小部分懸浮液，轉(zhuǎn)移到含有相同成份的新鮮培養(yǎng)基中。第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)的變化情況表現(xiàn)為S形曲線，其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)胞分裂活躍，數(shù)目迅速增加，所需的時(shí)間對(duì)不同植物不一樣。BatcnCulture

對(duì)于研究細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝并不是一種理想的培養(yǎng)方式。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四連續(xù)培養(yǎng)：是利用特別的培養(yǎng)容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的一種方式。連續(xù)培養(yǎng)過程中，不斷注入新鮮培養(yǎng)基，排掉等體積的用過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到不斷補(bǔ)充。ContinuousCulture對(duì)于植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究，決定各個(gè)生長(zhǎng)限制因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以及次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)都有一定意義。第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四◆懸浮培養(yǎng)條件

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的基本條件：

1、懸浮培養(yǎng)物質(zhì)分散性多，2、細(xì)胞團(tuán)較小均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同3、生長(zhǎng)迅速第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四◆懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)1、能大量提供均勻的植物細(xì)胞，也就是同步分裂的細(xì)胞。2、細(xì)胞增殖速度快，適應(yīng)于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。3、需要特殊的設(shè)備，如大型搖床、轉(zhuǎn)床、連續(xù)培養(yǎng)裝置、倒置式顯微鏡等，成本較高。第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四選材料：一般條件下，以幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為最佳（質(zhì)量好，分化能力強(qiáng)）。用顆粒細(xì)小，疏松易碎，外觀濕潤(rùn)，鮮艷的白色或黃色的愈傷組織，比較疏松易碎，經(jīng)過幾次篩選，繼代全穩(wěn)定后，可以用于誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞系。第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四激素：2ml/L4-D0.5ml/L6-BA和NAA培養(yǎng)基：N6，MS，B5（單子葉），MS，B5，LS，SL（雙子葉植物）誘導(dǎo)疏松愈傷組織有利的有機(jī)附加物，水解酪蛋白L-脯氨酸，谷氨酰胺，蔗糖濃度降低。第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物

通過植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)出藥品，農(nóng)藥，香料，色素及食品添加劑。第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四9.3單細(xì)胞培養(yǎng)

方法看護(hù)培養(yǎng)法（nursecultivationmethord）平板培養(yǎng)法（platecultivationmethod）微室培養(yǎng)法（microchambercultivationmethod）第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四看護(hù)培養(yǎng)法

把單個(gè)細(xì)胞置于一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織（也稱看護(hù)愈傷組織，nursecalli）上培養(yǎng)，在愈傷組織和培養(yǎng)的細(xì)胞之間用一片濾紙相隔。這培養(yǎng)的單細(xì)胞長(zhǎng)出微小的細(xì)胞團(tuán)之后，再移至瓊脂培養(yǎng)基上。第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四平板培養(yǎng)法1將懸浮培養(yǎng)物過濾（除去組織塊和細(xì)胞團(tuán)，保留游離細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)）2將液體培養(yǎng)基中加入0.6%-1.0%的瓊脂，使其融化，冷卻到35℃。3以上兩種溶液等量混合，注入培養(yǎng)皿用封口膜封好，置于25℃黑暗中培養(yǎng)。第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四微室培養(yǎng)法由懸浮培養(yǎng)物中取出一滴含單細(xì)胞的培養(yǎng)液，置于一張無菌載波片上，在培養(yǎng)基的四周與隔一定距離涂上一圈石蠟油，然后在左右兩側(cè)各加一滴石蠟油并分別置一張蓋波片，第三張蓋波片架在前兩個(gè)蓋波片之間，然后將整張載波片置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

第二十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、掌握單細(xì)胞的分離方法。2、理解細(xì)胞懸浮培養(yǎng)類型及其條件。3、掌握單細(xì)胞培養(yǎng)方法和