放射免疫熒光標記免疫詳解

放射免疫熒光標記免疫詳解演示文稿本文檔共42頁；當前第1頁；編輯于星期六\6點27分優(yōu)選放射免疫熒光標記免疫本文檔共42頁；當前第2頁；編輯于星期六\6點27分免疫標記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標記靈敏度特異性免疫標記技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏度免疫技術(shù)+標記技術(shù)本文檔共42頁；當前第3頁；編輯于星期六\6點27分檢測方法檢測范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）本文檔共42頁；當前第4頁；編輯于星期六\6點27分標記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學方法與化合物連接。免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。標記免疫分析：是利用多種標記技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合而建立的測定技術(shù)體系。其核心即是高靈敏性和高度特異性的有機結(jié)合。標記免疫技術(shù)－基本概念本文檔共42頁；當前第5頁；編輯于星期六\6點27分常見免疫標記技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)

本文檔共42頁；當前第6頁；編輯于星期六\6點27分放射免疫技術(shù)

本文檔共42頁；當前第7頁；編輯于星期六\6點27分1959年，美國，Yalow和Berson測定血清胰島素含量（標記抗原）1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎

放射免疫分析技術(shù)

（Radioimmunoassay，RIA）

優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，結(jié)果準確，檢樣用量少，結(jié)果重復性好，操作易自動化；缺點：對抗體質(zhì)量要求高，有放射性危害，檢測儀器價格較高本文檔共42頁；當前第8頁；編輯于星期六\6點27分放射免疫技術(shù)分類1.放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)

以標記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。2.免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)

以過量標記抗體與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標記抗體。3.其他：

放射受體分析(radioreceptorassay,RRA)放射配體結(jié)合分析(radioligandbindingassay,RBA)本文檔共42頁；當前第9頁；編輯于星期六\6點27分

Ag

Ab

*Ag

Ag-Ab++標記抗原（F）特異性抗體被檢抗原非標記抗原抗體復合物標記抗原抗體復合物（B）

*Ag-Ablimited,competitive

1.1放射免疫分析（RIA）技術(shù)原理本文檔共42頁；當前第10頁；編輯于星期六\6點27分抗原標準品與待測抗原結(jié)構(gòu)---完全相同/結(jié)構(gòu)相似且親和力相近純度---純度90%以上（免疫純）

較高的放射比放射性同位素特異性抗體

特異性高、親和力高（Ka）、效價高

?！叭摺保?/p>

1.2放射免疫技術(shù)基本條件本文檔共42頁；當前第11頁；編輯于星期六\6點27分標記核素125I

3H射線γβ理化性活潑差核素豐度>90%－半衰期

60.2d12.3y標記方法簡單復雜標記設(shè)備低廉(γ計數(shù)儀)昂貴(β液閃儀)測量條件簡單

復雜本文檔共42頁；當前第12頁；編輯于星期六\6點27分氯胺-T法：最常用的125I標記法，125I與酪氨酸共價結(jié)方法簡便，但易造成蛋白質(zhì)的損傷乳過氧化酶法（LPO）：標記方法更溫和，對被標記物的生物活性影響125I-標記物的制備125I-標記物的純化Sephadex層析，硅膠G薄板層析，HPLC分離本文檔共42頁；當前第13頁；編輯于星期六\6點27分125I-標記物的鑒定比放射性：單位化學量標記物中所含的放射性強度;免疫活性：與過量抗體反應(yīng)的百分比越大，標記物免疫活性越好本文檔共42頁；當前第14頁；編輯于星期六\6點27分游離抗原與免疫復合物的分離第二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響操作應(yīng)簡單、重復性好經(jīng)濟本文檔共42頁；當前第15頁；編輯于星期六\6點27分測量、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

計算

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)擬合注：T即是B（標記的復合物）與F（標記抗原）的總和本文檔共42頁；當前第16頁；編輯于星期六\6點27分

Ag*AbAg

標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標準曲線上讀知含量

測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測定法(RIA)示意圖本文檔共42頁；當前第17頁；編輯于星期六\6點27分

1.3放射免疫技術(shù)基本類型液相法平衡法（一步法）順序加樣法固相法本文檔共42頁；當前第18頁；編輯于星期六\6點27分免疫放射分析技術(shù)

（immunoradiometricassay，IRMA）1968年，Miles和Hales應(yīng)用同位素標記胰島素抗體，成功檢測牛血清中的胰島素。Type

IRMARIA被標記物質(zhì)抗體抗原抗體用量過量限量被檢抗原相對分子量相對較大相對較小反應(yīng)方式分步結(jié)合競爭結(jié)合B、F分離方法固相洗滌分離液相沉淀/吸附分離本文檔共42頁；當前第19頁；編輯于星期六\6點27分2.1免疫放射技術(shù)基本條件標記抗體的制備

抗體親和力要求不高固相抗原免疫吸附劑

對抗原吸附力強，對非特異性蛋白吸附少，結(jié)合過程中高度分散（重氮化纖維素，瓊脂糖4B珠）本文檔共42頁；當前第20頁；編輯于星期六\6點27分2.2免疫放射技術(shù)基本類型

經(jīng)典IRMA）本文檔共42頁；當前第21頁；編輯于星期六\6點27分雙抗夾心法2.2免疫放射技術(shù)基本類型本文檔共42頁；當前第22頁；編輯于星期六\6點27分放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強、精密度好,常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足,RIA將逐漸被取代。放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用本文檔共42頁；當前第23頁；編輯于星期六\6點27分熒光免疫技術(shù)Immunofluorescencetechnique，IFA本文檔共42頁；當前第24頁；編輯于星期六\6點27分Introduction:1958年，Riggs等合成了異硫氰酸熒光黃（fluorescentisothiocyanate，F(xiàn)ITC）；Marshall對熒光標記方法進行了改進，熒光技術(shù)逐漸推廣1942年，Coons等，異硫氰酸熒光素標記抗體，檢測小鼠組織切片中可溶性肺炎鏈球菌多糖抗原IFA熒光素敏感可測抗原抗體反應(yīng)特異性顯微技術(shù)高度精確優(yōu)點：特異性強，敏感性高，速度快，結(jié)果直觀---病原微生物缺點：熒光標本保存難（淬滅）非特異性染色本文檔共42頁；當前第25頁；編輯于星期六\6點27分熒光素具有共軛雙鍵體系的化學結(jié)構(gòu)通常處于最低能量狀態(tài)---基態(tài)激發(fā)光（紫外光）照射，躍遷到激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，釋放光子能量（波長較長的可見光---熒光）

熒光免疫分析（IFA）技術(shù)原理本文檔共42頁；當前第26頁；編輯于星期六\6點27分

熒光免疫分析（IFA）技術(shù)原理YYY本文檔共42頁；當前第27頁；編輯于星期六\6點27分

一種有機或無機化學物質(zhì)，其接受激發(fā)光后，能夠以發(fā)射光形式產(chǎn)生明亮的熒光而作為染料使用。

各種熒光素都有各自的激發(fā)波長和發(fā)射波長。因發(fā)射波長不同而顏色不同。

異硫氰酸熒光黃（FITC），四乙基羅丹明（Rb200），藻紅蛋白（PE）。

熒光免疫分析（IFA）基本條件

1.熒光素本文檔共42頁；當前第28頁；編輯于星期六\6點27分較高較穩(wěn)定的熒光效率具有能與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價鍵的化學基團與蛋白質(zhì)結(jié)合簡單快速結(jié)合產(chǎn)物的熒光顏色與實驗對象的自發(fā)熒光對比鮮明結(jié)合物具有一定的耐貯藏性

標記用熒光素應(yīng)具備的條件本文檔共42頁；當前第29頁；編輯于星期六\6點27分抗體：特異性強、效價高、標記后活性高標記前：梅花狀雙擴測效價標記抗體種類：多克隆抗體、單克隆抗體、葡萄球菌A蛋白（熒光二抗通用試劑）

2.待標記抗體1mg/mL本文檔共42頁；當前第30頁；編輯于星期六\6點27分FITC（異硫氰酸熒光黃）標記抗體

Marsshall法

原理當FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個。

3.熒光標記抗體制備與純化

熒光素-FITC-N＝C＋N-蛋白質(zhì)FITC-N–C–N-蛋白質(zhì)

‖‖SHHHSH

本文檔共42頁；當前第31頁；編輯于星期六\6點27分

操作流程抗體的準備：20mg/ml(抗體+生理鹽水+碳酸鹽緩沖液）

碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC

（抗體與熒光素比例為50-100:1）標記：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h，4℃透析：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0緩沖鹽水透析過夜，0-4℃過柱：葡萄糖凝膠G50或G25柱分離游離熒光素保存：4℃-40℃等量甘油分裝保存。

3.熒光標記抗體制備與純化本文檔共42頁；當前第32頁；編輯于星期六\6點27分

4.熒光標記抗體鑒定1特異性染色效價測定--與相應(yīng)抗原標本染色2非特異性染色測定--與相類似抗原標本染色3吸收試驗---在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽性標本染色，結(jié)果無明顯陽性熒光。4F/P比值的測定方法F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，

F/P=1-2，過高------非特異染色增強；過低------熒光很弱，降低敏感性。本文檔共42頁；當前第33頁；編輯于星期六\6點27分

經(jīng)典熒光抗體染色法本文檔共42頁；當前第34頁；編輯于星期六\6點27分流式細胞儀（FlowCytometor,FCM），以熒光免疫技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的專門的細胞分析技術(shù)。是一項集液流噴射技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的檢測儀器。

現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)

1.流式細胞技術(shù)本文檔共42頁；當前第35頁；編輯于星期六\6點27分1.流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)2.激光光源及光束形成系統(tǒng)3.光學系統(tǒng)4.信號檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)5.細胞分選系統(tǒng)

流式細胞儀工作原理本文檔共42頁；當前第36頁；編輯于星期六\6點27分熒光染色的細胞（微粒）懸液標本HighPressure流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)本文檔共42頁；當前第37頁；編輯于星期六\6點27分若干組透鏡、濾光片、小孔---將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器本文檔共42頁；當前第38頁；編輯于星期六\6點27分

單細胞分析：任何單細胞懸液，如血液、骨髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞，實體組織經(jīng)處理后制成單細胞懸液?？焖俜治觯簶O短時間內(nèi)可分析大量細胞，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。

流式細胞技術(shù)應(yīng)用本文檔共42頁；當前第39頁；編輯于星期六\6點27分多參數(shù)分析：可同時分析單個細胞的多種特征,當同時用多種分子探針,如用不同熒光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色,通過流式細胞分析,即可獲得單細胞的多種信息,使細胞亞群的識別、計數(shù)等更為準確。定性或定量分析：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、Ca2+濃度等均可進行單細胞水