細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用

第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程概述第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)知識第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件第四節(jié)魚類動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用本章內(nèi)容本文檔共121頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\22點21分第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述本文檔共121頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\22點21分瓶子中的細(xì)胞本文檔共121頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)：將組織分散成單細(xì)胞，使其在類似于體內(nèi)生存環(huán)境、適宜的體外條件下的生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)與功能的技術(shù)。培養(yǎng)過程中細(xì)胞不再形成組織。培養(yǎng)對象（培養(yǎng)物）是單個細(xì)胞（群）。本文檔共121頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\22點21分（1）概念類似、內(nèi)涵相近（2）培養(yǎng)對象、培養(yǎng)物的差異（3）二者無嚴(yán)格的界限，可以相互轉(zhuǎn)化辨別：細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)的區(qū)別和聯(lián)系？本文檔共121頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)（1）技術(shù)的難度（2）專業(yè)的切合角度（3）關(guān)注熱度和應(yīng)用價值課程內(nèi)容微生物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共121頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\22點21分①營養(yǎng)要求復(fù)雜、培養(yǎng)條件嚴(yán)格②培養(yǎng)的細(xì)胞容易發(fā)生變化③培養(yǎng)與真實的生存環(huán)境有差異①簡化生長環(huán)境、方便控制因素②細(xì)胞群均一性好、大量、成本低③大規(guī)模生產(chǎn)生物制品細(xì)胞培養(yǎng)的利與弊本文檔共121頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程的關(guān)系本文檔共121頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。本文檔共121頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程的最基礎(chǔ)、最核心的技術(shù)。本文檔共121頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論方法，按照人們的設(shè)計，通過細(xì)胞水平上的操作，定向改造細(xì)胞或生物體、創(chuàng)造新種、加速繁育、獲得產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞器/核移植基因轉(zhuǎn)移染色體操作本文檔共121頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程通過人工培養(yǎng)獲得細(xì)胞或細(xì)胞代謝產(chǎn)物本文檔共121頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程獲得具有新遺傳特性或特定屬性的產(chǎn)物、組織或生物體本文檔共121頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。核移植、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、胚胎發(fā)育綜合應(yīng)用克隆羊本文檔共121頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程無限細(xì)胞系、細(xì)胞融合、細(xì)胞免疫的綜合應(yīng)用本文檔共121頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程染色體技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)的綜合應(yīng)用多倍體育種本文檔共121頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史1907年：哈里森（Harrison），蛙胚神經(jīng)組織，單玻片懸滴培養(yǎng)法創(chuàng)始人。1923年，卡雷爾（Carrel），卡氏瓶培養(yǎng)法，細(xì)胞組織生存空間的開拓者。1951年，厄爾（Eagle），體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基開發(fā)者。

波米拉（Pomerat），懸浮培養(yǎng)。1957年，杜爾貝科（Dulbecco），胰蛋白酶消化單層細(xì)胞培養(yǎng)法先行者。本文檔共121頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用動物育種生物制品生產(chǎn)生物基礎(chǔ)研究臨床醫(yī)學(xué)本文檔共121頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\22點21分醫(yī)學(xué)診斷與治療（1）疾病診斷（2）細(xì)胞植入治療羊膜穿刺術(shù)地中海貧血骨髓細(xì)胞本文檔共121頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\22點21分（3）藥物效應(yīng)檢測動物篩選細(xì)胞篩選高效、經(jīng)濟(jì)、特異性檢測有毒物質(zhì),把致癌、致畸形的物質(zhì)加入培養(yǎng)液，對培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行染色體的檢驗,進(jìn)而推斷物質(zhì)的毒性；本文檔共121頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\22點21分生物制品的生產(chǎn)夢想現(xiàn)實OR？？？本文檔共121頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\22點21分疫苗激素干擾素單克隆抗體這些都已經(jīng)成為現(xiàn)實……動物細(xì)胞作為表達(dá)宿主，可生產(chǎn)蛋白質(zhì)類的生物制品，病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體；本文檔共121頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期日\22點21分魚類病毒學(xué)：病毒的分離、鑒定以及病毒疫苗的制備魚類細(xì)胞毒理學(xué)：評價樣品對魚類細(xì)胞的毒性等水產(chǎn)生物基礎(chǔ)理論魚類免疫學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)在水產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用本文檔共121頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期日\22點21分第二節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)知識本文檔共121頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)本文檔共121頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期日\22點21分

英國科學(xué)家胡克（R.Hook,1635-1703),27歲成為英國皇家學(xué)會領(lǐng)導(dǎo)成員,發(fā)表對木栓的觀察，命名Cell。荷蘭人列文虎克（AntonivonLeeuwenhoek,1623-1723）用自磨鏡片做成顯微鏡第一次觀察了活的細(xì)菌和原生動物。本文檔共121頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期日\22點21分19世紀(jì)中期細(xì)胞學(xué)說建立施萊登施旺本文檔共121頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期日\22點21分19世紀(jì)中期細(xì)胞學(xué)說建立施萊登施旺細(xì)胞學(xué)說的要點：1、生物體都是由細(xì)胞構(gòu)成；2、細(xì)胞由分裂產(chǎn)生新細(xì)胞；3、細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能（生命活動）的基本單位。本文檔共121頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期日\22點21分非細(xì)胞結(jié)構(gòu):細(xì)胞結(jié)構(gòu)：病毒：HIV、SARS、流感病毒、噬菌體等原核細(xì)胞：真核細(xì)胞：藍(lán)藻細(xì)菌放線菌支原體衣原體立克次氏體所有動物除藍(lán)藻外的植物真菌：如蘑菇、酵母菌、霉菌生物本文檔共121頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期日\22點21分原核細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的本質(zhì)差異本文檔共121頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期日\22點21分原核細(xì)胞真核細(xì)胞無以核膜為界限的細(xì)胞核有以核膜為界限的細(xì)胞核較小較大只有核糖體一種細(xì)胞器多種復(fù)雜的細(xì)胞器無染色體，有DNA分子有染色體（DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的本質(zhì)差異本文檔共121頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期日\22點21分圓球形、多面體形、紡錘形、長梭形、管狀、長柱形、分枝狀、不規(guī)則性。細(xì)胞的多樣性本文檔共121頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期日\22點21分支原體巨型烏賊神經(jīng)細(xì)胞蕨藻鴕鳥卵卵細(xì)胞本文檔共121頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核膜細(xì)胞核核仁線粒體高爾基體核糖體細(xì)胞膜溶酶體中心體葉綠體細(xì)胞壁液泡動、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及區(qū)別本文檔共121頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞與植物細(xì)胞的比較細(xì)胞器動物細(xì)胞植物細(xì)胞細(xì)胞壁無有葉綠體無有液泡無有溶酶體有無圓球體無有營養(yǎng)方式異養(yǎng)自養(yǎng)通訊連接方式間隙連接胞間連絲中心體有無胞質(zhì)分裂方式收縮環(huán)細(xì)胞板本文檔共121頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞的分裂一個母細(xì)胞經(jīng)過一系列復(fù)雜的變化后，分裂成兩個子細(xì)胞的過程，叫做細(xì)胞分裂。受精卵兩個子細(xì)胞四個子細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分裂的意義？本文檔共121頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期日\22點21分單細(xì)胞生物個體數(shù)目增多細(xì)胞數(shù)目增多多細(xì)胞生物本文檔共121頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期日\22點21分2、細(xì)胞的生長與生長周期子細(xì)胞從周圍吸收營養(yǎng)，合成自身的組成物質(zhì)、不斷地長大的過程。生長的結(jié)果？生長生長本文檔共121頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期日\22點21分3、細(xì)胞的分化本文檔共121頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期日\22點21分產(chǎn)生了各種不同形態(tài)、功能的細(xì)胞，它們構(gòu)成了生物體的各種結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)環(huán)境。細(xì)胞分化的結(jié)果：在個體發(fā)育中，由一個或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定差異的過程，叫細(xì)胞分化。本文檔共121頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期日\22點21分12345細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞分化細(xì)胞生長本文檔共121頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞分裂、生長、分化的結(jié)果分裂：使細(xì)胞數(shù)目增多生長：使細(xì)胞體積增大分化：使細(xì)胞種類增多本文檔共121頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞有壽命嗎?細(xì)胞能無限制的分裂嗎?本文檔共121頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞的衰老、死亡本文檔共121頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞的衰老：一般指復(fù)制衰老，即體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。本文檔共121頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期日\22點21分形態(tài)：細(xì)胞水分減少導(dǎo)致細(xì)胞萎縮，體積變小。結(jié)構(gòu)：核增大，色素積累，染色質(zhì)固縮。功能：新陳代謝速度減慢，呼吸速度減慢（線粒體功能退化、形變）有些酶的活性降低（酪氨酸酶）細(xì)胞膜通透性功能改變。衰老細(xì)胞的主要特征本文檔共121頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞死亡自動死亡被動死亡(細(xì)胞凋亡)(細(xì)胞壞死)遺傳物質(zhì)控制外界因素最主要的一種方式，受Bcl-2家族、caspase家族等基因控制的主動的生理性細(xì)胞自殺行為。本文檔共121頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期日\22點21分凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。凋亡小體形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個凋亡小體。凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化。細(xì)胞凋亡過程本文檔共121頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期日\22點21分動物個體內(nèi)不同類型和壽命的細(xì)胞接近于動物的整體壽命的細(xì)胞，如神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞等。在胚胎發(fā)育終了時，這些細(xì)胞不再增加數(shù)量，在個體的生長期中它們可增長細(xì)胞體積，以使其與軀體成比例。它們隨著個體衰老而衰老，或者由于這些細(xì)胞的衰老、死亡引起個體死亡。緩慢更新的細(xì)胞，它們的壽命短于動物的平均壽命，如肝細(xì)胞，胃壁細(xì)胞等?？焖俑碌募?xì)胞，如皮膚的表皮細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等。本文檔共121頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期日\22點21分Hayflick界限細(xì)胞（至少是培養(yǎng)的細(xì)胞），不是不死的、而是有一定壽命的。它們的增殖能力不是無限的，而是有一定界限的。LeonardHayflick(1928~)正在檢查他培養(yǎng)的WI-38細(xì)胞本文檔共121頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期日\22點21分體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖與個體壽命的關(guān)系物種成纖維細(xì)胞傳代數(shù)個體最長壽命（年）龜90-125175水貂30-3410雞15-3530小鼠14-283.5人

胚胎40-60110

出生至15歲20-40

15歲以上10-30

早老病患者2-1010-20本文檔共121頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞的無限增殖與癌變癌Cancer基因控制無限增殖衰老死亡×本文檔共121頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期日\22點21分梅艷芳宮頸癌馬三立膀胱癌文興宇肺癌羅京淋巴癌陳曉旭乳腺癌本文檔共121頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期日\22點21分腫瘤細(xì)胞正常細(xì)胞為什么會轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞？癌細(xì)胞正常細(xì)胞原癌基因抑癌基因突變突變癌基因失去抑制作用不能控制（致癌因子的作用）不受控制，惡性增殖原癌基因抑癌基因癌基因本文檔共121頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期日\22點21分（1）物理致癌因子：輻射（紫外線、X射線、電離輻射等）致癌的外界因素本文檔共121頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期日\22點21分（2）化學(xué)致癌因子：無機(jī)物—如石棉、砷化物、鉻化物、鎘化物等；有機(jī)物—如黃曲霉素、亞硝胺、尼古丁、甲醛、苯、聯(lián)苯胺、煤焦油、苯并芘等（3）病毒致癌因子：感染人的細(xì)胞，將其基因整合進(jìn)入人的基因組，誘發(fā)癌變?nèi)纾焊腥疽腋尾《究烧T發(fā)肝癌；

感染人乳頭狀病毒可誘發(fā)宮頸癌；EB病毒是一種皰疹病毒，使兒童患淋巴癌、成人患鼻咽癌。本文檔共121頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期日\22點21分如何預(yù)防癌癥？本文檔共121頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期日\22點21分在多細(xì)胞生物中，每個個體細(xì)胞的細(xì)胞核具有個體發(fā)育的全部基因，只要條件許可，細(xì)胞都可發(fā)育成完整的個體。細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后仍具有形成完整有機(jī)體的潛能或特性。細(xì)胞的全能性本文檔共121頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期日\22點21分高度分化的植物體細(xì)胞具有全能性，離體植物細(xì)胞在一定營養(yǎng)的物質(zhì)、激素和其他適宜的外界條件下，能表現(xiàn)其全能性。本文檔共121頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期日\22點21分高度分化的動物體細(xì)胞也具有全能性嗎？？？？本文檔共121頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期日\22點21分誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPScell）創(chuàng)始人之一。2006年山中伸彌等科學(xué)家把4個轉(zhuǎn)錄因子通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細(xì)胞，使其變成多功能干細(xì)胞。這意味著未成熟的細(xì)胞能夠發(fā)展成所有類型的細(xì)胞。2007年，他所在的研究團(tuán)隊通過對小鼠的實驗，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)人體表皮細(xì)胞使之具有胚胎干細(xì)胞活動特征的方法。此方法誘導(dǎo)出的干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾呐K和神經(jīng)細(xì)胞，為研究治療多種心血管絕癥提供了巨大助力，這一研究成果在全世界被廣泛應(yīng)用。山中伸彌京都大學(xué)IPS細(xì)胞研究所所長2012年，獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎本文檔共121頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞全能性高低與細(xì)胞分化程度有關(guān)，分化程度越高，細(xì)胞全能性越低，全能性表達(dá)越困難。胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞多能干細(xì)胞全能干細(xì)胞專能干細(xì)胞干細(xì)胞本文檔共121頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞核的全能性本文檔共121頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期日\22點21分第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件本文檔共121頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞培養(yǎng)……是以第一流的技術(shù)為基礎(chǔ)的，沒有其它可接受的標(biāo)準(zhǔn)。高深的理論知識本身不能產(chǎn)生良好的培養(yǎng)。我相信有了實踐……才能產(chǎn)生滿意的結(jié)果?！秳游锝M織培養(yǎng)》英國，華斯萊實操理論＞本文檔共121頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期日\22點21分動物細(xì)胞培養(yǎng)的難點1、營養(yǎng)要求復(fù)雜；2、動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對剪切力敏感；3、適應(yīng)環(huán)境能力差，對環(huán)境（pH、溶解氧、溫度、剪切力）敏感；4、倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染。動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件本文檔共121頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期日\22點21分（1）無菌條件無菌條件是細(xì)胞體外培養(yǎng)最基本的條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。本文檔共121頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期日\22點21分蒸汽滅菌過濾除菌化學(xué)滅菌輻射滅菌火焰滅菌多重保險、確保無污染抗生素本文檔共121頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期日\22點21分無菌室（十萬級）無菌操作臺（百級）著裝視頻資料本文檔共121頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期日\22點21分污染難100%避免及時確認(rèn)污染采取必要措施看檢本文檔共121頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期日\22點21分及時確認(rèn)發(fā)生的微生物污染最常發(fā)生的是霉菌和細(xì)菌污染。霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認(rèn)細(xì)菌感染時，有的引起培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細(xì)菌，有的培養(yǎng)液無明顯改變?nèi)鐟岩晌廴?，必要時可向肉湯或瓊脂培養(yǎng)基里滴少量培養(yǎng)物，置37℃溫箱培養(yǎng)數(shù)日，觀察有無菌落形成，以驗證是否污染。經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染。PPLO體積小，只有0.25~1m大小，且無細(xì)胞壁。PPLO污染后的細(xì)胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的病理改變。本文檔共121頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期日\22點21分（2）營養(yǎng)條件動物細(xì)胞培養(yǎng)對營養(yǎng)要求非常嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖、核酸外，還需要血清。培養(yǎng)液是細(xì)胞營養(yǎng)的直接來源。本文檔共121頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期日\22點21分碳水化合物：提供碳骨架和能量氨基酸：12種基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和谷氨酰胺維生素：常用的有煙酰胺、葉酸、核黃素、維生素B12、泛酸、吡哆醇及維生素C，維持細(xì)胞生長生長因子：包括激素類物質(zhì)和促生長因子，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、生長調(diào)節(jié)素等無機(jī)鹽：鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等本文檔共121頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期日\22點21分血清成分：激素生長因子結(jié)合蛋白貼壁擴(kuò)展因子微量元素如硒缺點：價格貴、質(zhì)量不穩(wěn)定本文檔共121頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期日\22點21分（3）理化條件溫度pH滲透壓氣分壓體外體內(nèi)本文檔共121頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期日\22點21分①溫度維持細(xì)胞旺盛生長須有恒定適宜的溫度。細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，低溫下會使細(xì)胞代謝速率降低。溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這主要是由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定的。如人體細(xì)胞最適溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。恒溫培養(yǎng)箱本文檔共121頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期日\22點21分魚類是變溫動物，耐溫范圍較廣，因此魚類細(xì)胞培養(yǎng)對溫度的要求沒有哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)那么嚴(yán)格。牙鲆鰓細(xì)胞系大西洋鱈前腎巨噬細(xì)胞對蝦肌肉組織細(xì)胞草魚細(xì)胞水生哺乳動物本文檔共121頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期日\22點21分2）pH值：動物細(xì)胞生長大多需要輕微堿性環(huán)境，最佳為7.2~7.４過酸（低于6）或過堿（高于7.6）可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這主要與蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受損有關(guān)。耐受性強(qiáng)耐受性差本文檔共121頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期日\22點21分本文檔共121頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期日\22點21分3）氣體二氧化碳培養(yǎng)箱氣體是細(xì)胞生長代謝的必需條件，主要包括氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)(TCA)，產(chǎn)生細(xì)胞生長增殖所需的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。二氧化碳主要具有調(diào)節(jié)pH的作用。供給的體積分?jǐn)?shù)一般為5%。本文檔共121頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期日\22點21分4）滲透壓用平衡鹽溶液配制各種試劑、洗滌，主要含無機(jī)鹽和葡萄糖。魚類細(xì)胞可耐受的滲透壓范圍更廣。某些海水魚，需要添加1.5%的氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓。本文檔共121頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期日\22點21分海洋節(jié)肢動物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共121頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期日\22點21分（4）常用培養(yǎng)器培養(yǎng)板培養(yǎng)皿細(xì)胞反應(yīng)器疫苗、激素生產(chǎn)培養(yǎng)瓶本文檔共121頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期日\22點21分第四節(jié)

原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)本文檔共121頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期日\22點21分一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型和特征貼壁型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞(非貼壁型)兼性貼壁細(xì)胞：種類較少成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞型不規(guī)則多角形放射狀梭形火焰形球形游走型、多形型密度高、適用大規(guī)模培養(yǎng)三大類本文檔共121頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期日\22點21分培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點a)貼附生長b)接觸抑制c)密度依賴性細(xì)胞貼壁是一個非常復(fù)雜的多因素相關(guān)過程，支持物表面的清潔程度、所帶電荷以及培養(yǎng)基中的一些蛋白、激素、多肽類物質(zhì)都會影響，血清促進(jìn)細(xì)胞貼壁主要是糖蛋白起的作用。三大特點粘附是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式本文檔共121頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期日\22點21分粘附是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義：有兩方面結(jié)果：基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。本文檔共121頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期日\22點21分培養(yǎng)細(xì)胞的貼附、伸展1234本文檔共121頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期日\22點21分接觸抑制：細(xì)胞在貼壁生長過程中，隨著細(xì)胞分裂，數(shù)量增加，形成一個單層，此時細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。50代以后失去接觸抑制接觸抑制本文檔共121頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期日\22點21分1.培養(yǎng)的細(xì)胞之間

仍有在形態(tài)和機(jī)能上的相互依存關(guān)系。在結(jié)構(gòu)上，如：上皮細(xì)胞仍見有橋粒在生理活動上，單個細(xì)胞雖能生長繁殖,但不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)，當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運動停止，細(xì)胞相互溝通生物信息的結(jié)果。2.培養(yǎng)的細(xì)胞和基質(zhì)之間

對細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性

本文檔共121頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期日\22點21分去分化(脫分化):

各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個性”，表現(xiàn)出某種趨同性

如:培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在適當(dāng)刺激下，可分化為

其它結(jié)締組織細(xì)胞和肌組織細(xì)胞，表現(xiàn)出類似未分化的間充質(zhì)細(xì)胞的特性，‘返祖’。1.

去分化并不意味著完全返回胚胎時期的原始細(xì)胞狀態(tài)

如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù)但已經(jīng)具備的生物電活動特性不會完全失去

本文檔共121頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期日\22點21分2.再分化：可重新表現(xiàn)出分化特點如：

把表皮細(xì)胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，但，這種能力會隨著培養(yǎng)時間延長逐漸喪失?？傊?，體外培養(yǎng),使細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大本文檔共121頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期日\22點21分1、取材無菌器械鋒利及時培養(yǎng)剔除無關(guān)成分營養(yǎng)豐富記錄保存信息資料視頻原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是從供體取出組織或分離細(xì)胞接種培養(yǎng)后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。二、動物細(xì)胞的原代培養(yǎng)本文檔共121頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期日\22點21分選取原則：個體健壯、無病，無外傷，避免選用某些攜帶內(nèi)源性病菌的魚類。個體越年輕，其細(xì)胞一般保持較強(qiáng)的分裂能力，體外培養(yǎng)成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼體應(yīng)該是細(xì)胞傳代的很好材料。組織材料的來源水生無脊椎動物：主要包括甲殼類、貝類、海綿等。水生脊椎動物，主要是魚類。本文檔共121頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期日\22點21分供培養(yǎng)的組織材料要經(jīng)過嚴(yán)格的擦洗、消毒與多次沖洗。海洋動物的組織還需用75%酒精、稀高錳酸鉀溶液或二氯化汞、雙氯苯雙胍己烷溶液等再處理，以殺滅海洋中一些弧菌類有機(jī)體。再用維持液反復(fù)沖掉多余消毒劑，這樣處理既能殺死細(xì)菌又能維持細(xì)胞活性。組織材料的清洗消毒弧菌是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌。如霍亂弧菌?；【鷮購V泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)。目前弧菌有91種。主要魚貝類致菌為：溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌等本文檔共121頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞懸液的分離：組織材料的分離組織塊的分離：機(jī)械分散法（多級篩網(wǎng)）剪切分離法酶消化法離心法血液、羊水、胸腔水、腹水胰蛋白酶膠原蛋白水解酶本文檔共121頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期日\22點21分2、培養(yǎng)方法常用，操作簡便；成功率較高適合組織量少；生長較慢、耗時長注意事項：輕拿輕放，及時更換培養(yǎng)液將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。①組織塊培養(yǎng)法本文檔共121頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期日\22點21分②消化培養(yǎng)法步驟繁瑣、易污染、成本高；適用大量組織、耗時短、效率高；應(yīng)用消化分散法將組織細(xì)胞間質(zhì)（基質(zhì)、纖維）除去，使細(xì)胞分散，然后接種培養(yǎng)。酶消化本文檔共121頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期日\22點21分酶消化法采用較為廣泛的方法，適用于絕大多數(shù)組織，并且在貼壁細(xì)胞傳代時也多用此種方法。經(jīng)常采用的消化酶有胰蛋白酶、膠原酶等。利用消化法得到的細(xì)胞量大，均一性好，細(xì)胞貼壁后可迅速形成單層。要注意不同組織需不同的消化酶濃度以及消化時間，否則會因消化過度而對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。胰酶-EDTA消化液能與細(xì)胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接松散冷消化熱消化本文檔共121頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期日\22點21分a、貼壁培養(yǎng)法b、懸浮培養(yǎng)法少數(shù)動物細(xì)胞屬于懸浮生長型，如淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。懸浮生長的細(xì)胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便。傳代時不需要再分散，此法細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高。多數(shù)細(xì)胞屬于貼壁生長型，使分散的單細(xì)胞先貼附在瓶壁或支撐物上后，再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。最終在附著表面擴(kuò)展成單層。有接觸抑制的特性，一旦細(xì)胞形成單層,生長就會受到抑制，細(xì)胞產(chǎn)量有限。本文檔共121頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期日\22點21分

（1）組織塊固定法當(dāng)組織量較少時可采用此法。它是將組織剪成約一立方毫米的小塊,按一定比例將組織塊貼在瓶壁上,至少三十分鐘以上,然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。（2）機(jī)械分散法此法適用于細(xì)胞間連接較松散的組織,如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐的小塊,放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內(nèi),用手的壓力將組織擠出網(wǎng)孔,最后將分散的組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。（3）絡(luò)合劑分散法目前使用的絡(luò)合劑主要是乙二胺四乙酸,它能與細(xì)胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接松散,經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細(xì)胞培養(yǎng)及上皮型細(xì)胞系的傳代。（4）酶消化法該法是目前采用極為廣泛的方法,適用于絕大多數(shù)組織器官。所用的酶主要是胰酶,常用濃度是0.25%。根據(jù)酶消化時溫度的不同,又可進(jìn)一步分為冷消化法及熱消化法。（5）冷消化法此法是將組織剪成約刀的小塊,然后置一倍體積的胰酶中,四攝氏度培養(yǎng)。本文檔共121頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期日\22點21分草魚肝臟組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)：1．魚體用0.01%高錳酸鉀溶液浸泡消毒半小時。2．用70%酒精棉花擦洗解剖部位。3．剖開腹腔，取出0.5cm3的組織，除去粘膜和血塊等，小燒杯中用小剪刀剪碎，用Hanks液洗3～4次。4．轉(zhuǎn)入三角瓶，加0.25%胰酶20℃消化30分鐘。5．消化完畢，加少許Hanks液，離心6．倒去消化液，用Hanks液重懸1~2次。7．用含有小牛血清的生長液重懸。8．計數(shù)，分裝培養(yǎng)。實例視頻資料本文檔共121頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期日\22點21分細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后，傳到新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)的過程。進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)的原因？初次傳代的注意點：（1）充分生長；（2）消化時間的控制；（3）接種量大一些。細(xì)胞濃度應(yīng)在200萬個細(xì)胞/毫升以上，接種量太少不容易傳代成功。三、動物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)本文檔共121頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期日\22點21分1懸浮細(xì)胞的傳代直接傳代：使懸浮細(xì)胞沉底，吸掉約2/3上清，懸浮細(xì)胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。離心傳代：將培養(yǎng)液于~1000rpm離心，棄去上清，加入新的生長液，吹打懸浮細(xì)胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。本文檔共121頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期日\22點21分2貼壁細(xì)胞的傳代確認(rèn)細(xì)胞有無污染，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；消化液量要適當(dāng)，以搖動時能蓋滿單層細(xì)胞為度；消化時間不宜過久，一般在室溫下靜置2～5min,當(dāng)見細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞層出現(xiàn)麻布樣網(wǎng)孔、細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，即可終止消化。終止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計數(shù)后記錄其濃度。接種培養(yǎng)。消化傳代視頻資料本文檔共121頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期日\22點21分1．待細(xì)胞長成單層后，倒去培養(yǎng)液，加胰酶-EDTA消化液，當(dāng)單層細(xì)胞呈白色一片，而且細(xì)胞間出現(xiàn)針孔狀空隙時，停止消化，再倒去消化液。2．加入細(xì)胞生長液，吹打分散3．分裝培養(yǎng)，一般一瓶傳二瓶，有的細(xì)胞株可以分裝三瓶本文檔共121頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期日\22點21分培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生命期一代貼附生長細(xì)胞的生長過程兩個型曲線培養(yǎng)細(xì)胞的生命期本文檔共121頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期日\22點21分衰老死亡總細(xì)胞產(chǎn)量培養(yǎng)時間系列傳代原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細(xì)胞的生命期細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系移植培養(yǎng)123再培養(yǎng)間隔本文檔共121頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期日\22點21分衰退期細(xì)胞增生數(shù)時間停滯期指數(shù)生長期潛伏期增殖速率極限點細(xì)胞數(shù)極限點一代貼附生長細(xì)胞的生長過程培養(yǎng)動物細(xì)胞的不適應(yīng)本文檔共121頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期日\22點21分游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘~4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期：此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。停止期（平臺期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂，機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性本文檔共121頁；