第六章酶與細(xì)胞固定化

第六章酶與細(xì)胞固定化第一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

第一節(jié)酶的固定化第二節(jié)微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞固定化第三節(jié)原生質(zhì)體固定化

第二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第一節(jié)酶的固定化一、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)二、酶的固定化方法三、固定化酶性質(zhì)四、固定化酶的應(yīng)用第三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶的固定化：借助各種物理或化學(xué)方法，將酶固定于水不溶性載體上的過(guò)程。固定化酶(immobilizedenzyme)

：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。（固定化酶又叫水不溶性酶）第四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定化酶的優(yōu)點(diǎn)③可以反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化。②反應(yīng)后易于分離，簡(jiǎn)化了提純工藝，產(chǎn)物得率高，利于提高產(chǎn)品質(zhì)量。①可提高穩(wěn)定性④反應(yīng)過(guò)程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化。⑤適應(yīng)于多酶反應(yīng)體系。一、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)第六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定化酶缺點(diǎn)缺點(diǎn)③比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。②固定化成本高。①酶固定化時(shí)酶的活力有所損失。第七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、酶的固定化方法1.吸附法2.包埋法3.共價(jià)偶聯(lián)法4.交聯(lián)法固定化方法吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子鍵結(jié)合法物理吸附法共價(jià)鍵結(jié)合法第八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、吸附法

（1）定義：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、大孔合成樹(shù)脂等。第九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)點(diǎn)：酶的活性中心不易被破壞，酶活力損失小。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。第十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）制備方法：a.靜態(tài)法(statiaprocedure)：沒(méi)有攪拌、振搖情況下，將載體直接加入酶溶液，通過(guò)自然吸附、解吸、再吸附等過(guò)程、制備固定化酶。該法操作簡(jiǎn)便，但效率低，耗時(shí)，吸附量小且不均勻。b.電沉積法(electrodepositionprocedure)：

在酶溶液中放置兩個(gè)電極，在電極鄰近加入載體，接通電源，酶移向電極并沉積到載體表面，以制備固定化酶。該法可提高吸附時(shí)局部濃度，增加吸附量，但要注意酶在電場(chǎng)中的穩(wěn)定性。第十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五c.混和振搖裝載法(mixingorshakingbathloading)：是實(shí)驗(yàn)室常用方法，載體與酶液混和后，要在攪拌下或搖床連續(xù)振搖下完成固定化。該法固定化較為均勻，要注意攪拌或振搖速率，既不破壞酶和載體結(jié)構(gòu)，又要達(dá)到充分混和目的。d.反應(yīng)器裝載法(reactorloadingprocess)：這是工業(yè)上常用方法，它將固定化和其后的應(yīng)用連在一起，即先將載體裝于反應(yīng)器中，再加上酶液，然后通過(guò)循環(huán)流振動(dòng)方式使酶和載體達(dá)到充分混和。第十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(1)定義：將酶分子包埋在各種多孔載體中，制成一定形狀的固定化酶的技術(shù)，主要用于水溶性小分子底物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。2、包埋法：(entrapment)(2)包埋法的類型：酶被包埋成網(wǎng)格型稱為凝膠包埋法；酶被包埋成微膠囊型稱為微膠囊包埋法。

包埋過(guò)程不發(fā)生反應(yīng)第十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

凝膠包埋法（網(wǎng)格型）：將酶包埋在凝膠內(nèi)部的微孔中。微膠囊包埋法（微囊型）：將酶包埋在高分子半透膜中。第十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五a.凝膠包埋：凝膠包埋條件酶活性強(qiáng)度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂聚合反應(yīng)部分失活高使用的多孔載體及其特點(diǎn)第十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：過(guò)硫酸鉀Acr+Bis+E(orcell)IE(orIC)

二甲氨基丙腈

第十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五b.微囊型包埋(microencapsulation)：又稱半透膜包埋法：

將酶包埋于由各種高分子聚合物（直徑幾十微米～幾百微米，厚約25mm的半透膜）制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉膠膜②制備方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性劑乳化液包埋法。分述如下：第十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五界面沉降法：利用高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而將酶包埋于中。

例：以火棉膠（硝酸纖維素）包埋酶時(shí)，先將酶的水溶液在含有硝酸纖維素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纖維素在酶液液滴周圍凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉膠囊。第十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

界面聚合法：

將疏水性和親水性單體在界面進(jìn)行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。

例：以尼龍膜包埋酶時(shí)，將酶液及親水性單體（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，將疏水性單體（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等與水混溶的有機(jī)溶劑。然后，將這兩種互不相溶的液體混和在一起。加入乳化劑乳化，使酶液分散成小液滴。此時(shí)，親水性的已二胺與疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，將酶包埋在小球內(nèi)。再加Tween—20，使乳化破壞，用離心分離即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。第十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五表面活性劑乳化液膜法：

在酶的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達(dá)到包埋的目的。該法不含化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。第二十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五脂質(zhì)體包埋：

將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。脂質(zhì)體包埋的特點(diǎn)：

具有一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。第二十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五與凝膠包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1）固定化酶顆粒小。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。

第二十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。第二十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素3.結(jié)合法載體通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合的固定化方法。第二十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素優(yōu)缺點(diǎn)：催化效率損失小；結(jié)合力弱，改變pH和離子強(qiáng)度可使酶脫落。第二十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。2）共價(jià)結(jié)合法第二十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五A.載體：親水載體優(yōu)于疏水載體

如:天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機(jī)械性能差瓊脂糖

合成聚合物：

聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍親水性好，有一定機(jī)械強(qiáng)度第二十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2）偶聯(lián)方法：芳香氨基羥基羥甲基氨基載體上的功能基團(tuán)酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)游離氨基胍基酚羥基巰基咪唑基羥基重氮法疊氮法鹵化氫法烷化法縮合法常用的偶聯(lián)反應(yīng)第二十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五①重氮法：這是帶芳香氨基載體的主要反應(yīng)，即載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基、咪唑基或氨基直接進(jìn)行偶聯(lián)。（見(jiàn)示意圖）例如對(duì)氨基苯甲基纖維素可與亞硝酸反應(yīng)R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2R—O—CH2—C6H4—N+＝N+H2O載體活化后，活潑的重氮基團(tuán)可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)值得固定化酶。R—O—CH2—C6H4—N+===N+ER—O—CH2—C6H4—N＝

N—E亞硝酸可由亞硝酸鈉和鹽酸反應(yīng)生成：

NaNO2+HClHNO2+NaCl第二十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五②疊氮法：含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成疊氮化合物。以羧甲基纖維素為例，先將羧甲基纖維素甲酯化，再與肼反應(yīng)生成羧甲基纖維素的酰肼衍生物，然后再與亞硝酸反應(yīng)得到疊氮化合物，這種產(chǎn)物能在低溫、pH7.5—8.5的情況下和酶的氨基直接偶聯(lián)。疊氮衍生物也能和羥基、酚羥基或巰基反應(yīng)。R—O—CH2—COOH+CH3OHR—O—CH2—COO—CH2+H2OCMCCMC甲酯R-O-CH2-COO-CH2+NH2-NH2R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OHCMC甲酯肼CMC酰肼衍生物R—O—CH2—CO—NH—NH2+HNO2R—O—CH2—CO—N3+2H2OR—O—CH2—CO—N3+H2N—ER—O—CH2—CO—NH—ER—O—CH2—CO—N3+HO—ER—O—CH2—CO—O—ER—O—CH2—CO—N3+SH—ER—O—CH2—CO—S—E第三十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五③溴化氰法(常用)：帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應(yīng)生成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)。第三十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五④烷基化法：含羥基的載體也可在堿性條件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反應(yīng)，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。第三十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五⑤縮合法：利用羰二亞胺的活化作用，使氨基與羧基直接偶聯(lián)縮合成肽鍵的反應(yīng)，適用于帶羧基或氨基的載體。第三十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。

第三十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間、酶分子與惰性蛋白或酶分子與載體間發(fā)生交聯(lián)，形成共價(jià)鍵連接來(lái)制備固定化酶的方法。雙功能試劑：

常用的是戊二醛第三十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。

此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵。第三十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

在沒(méi)有其它載體參與，僅通過(guò)酶分子間交聯(lián)形成的固定化酶，顆粒很小，而且機(jī)械性能不佳，為克服這一缺點(diǎn)，一般可先將酶吸附于載體上，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi)，然后再交聯(lián)制成固定化酶“網(wǎng)”膜或“網(wǎng)”顆粒。這種方法又稱為雙重固定化法。第三十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)（修飾）。酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)（固定化）。第三十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。優(yōu)點(diǎn)：制備簡(jiǎn)單、結(jié)合牢固、可以長(zhǎng)時(shí)間使用。第三十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶和細(xì)胞固定化示意圖第四十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定化方法物理吸附法包埋法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法制備難易易較難易難較難結(jié)合程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能不能可能不能不能費(fèi)用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較第四十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定化方法物理吸附法包埋法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法制備難易易較難易難較難結(jié)合程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能不能可能不能不能費(fèi)用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較第四十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、固定化酶的性質(zhì)酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個(gè)與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會(huì)影響酶原有的性質(zhì)。第四十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.活力：

大多數(shù)酶固定化后，酶活性下降。原因：（1）構(gòu)象改變；（2）空間位阻

（3）活性中心與載體結(jié)合評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：

相對(duì)活力低于75%，沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。第四十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.穩(wěn)定性：

(4)對(duì)變性劑的耐受性提高，在尿素、有機(jī)溶劑和鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑的作用下，仍可保留較高的酶活力等。(1)對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。對(duì)酸堿耐受力增強(qiáng)。(2)固定化后半衰期增長(zhǎng)，保存穩(wěn)定性好。(3)對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解。第四十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響原因：

①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，并且固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形。②抑制酶自身降解，酶與載體固定化后失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了其自身的降解過(guò)程。③固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲，但是如果固定化觸及到酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降。第四十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.最適反應(yīng)pH：

酶經(jīng)固定化后，其作用的最適pH常會(huì)發(fā)生偏移，影響固定化酶最適pH的因素：

(1)載體性質(zhì)對(duì)最適pH影響：

帶負(fù)電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。

不帶電荷載體:最適pH一般不改變。(2)產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pH影響；酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性：最適pH向堿性偏移。酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為堿性：最適pH向酸性偏移。酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性：最適pH不改變。第四十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響原因：固相酶顆粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動(dòng)的液體包圍著，這層不流動(dòng)液體叫做擴(kuò)散層。載體的帶電性質(zhì)之所以會(huì)影響固定化酶的最適pH值，是由于在使用帶負(fù)電荷的載體時(shí)，載體會(huì)吸引反應(yīng)液中的氫離子(H+)到其附近，致使固定化酶所處反應(yīng)區(qū)域的pH值比周圍反應(yīng)液的pH值低一些，這樣就必須把反應(yīng)液的pH值提高一些，才能使酶充分發(fā)揮其催化功能。故此，固定化酶的最適pH顯得比游離酶的最適pH值高一些。反之，帶正電荷的載體對(duì)氫氧根負(fù)離子有吸引作用，由它制備的固定化酶的最適pH值要比游離酶的最適pH值低一些。第四十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響原因：固定化載體成為擴(kuò)散阻礙，使反應(yīng)產(chǎn)物向外擴(kuò)散受到一定的限制所造成的。當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物為酸性時(shí)，由于擴(kuò)散受到限制而積累在固定化酶所處的催化區(qū)域內(nèi)，使此區(qū)域內(nèi)的pH值降低，必需提高周圍反應(yīng)液的pH值，才能達(dá)到酶所要求的pH值。為此，固定化酶的最適pH值比游離酶要高一些。反之，反應(yīng)產(chǎn)物為堿性時(shí)，由于它的積累使固定化酶催化區(qū)域的pH值升高，故此使固定化酶的最適pH值比游離酶的最適pH值要低一些。第四十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.最適反應(yīng)溫度：

最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。

多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。第五十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五5.動(dòng)力學(xué)常數(shù)：Km與Vm

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。Vm固定化前后相同或接近（也有例外）。第五十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五6.底物特異性

固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會(huì)發(fā)生變化。第五十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響原因：

固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。酶固定在載體上以后，使大分子底物難于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量較小的底物受空間位阻作用的影響較小或不受影響，故與游離酶的作用沒(méi)有顯著不同。第五十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、固定化酶的應(yīng)用1.在食品工業(yè)中的應(yīng)用

2.在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

3.生物傳感器

4.環(huán)境保護(hù)

第五十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）乳制品中乳糖不耐癥：有些人體內(nèi)缺乏乳糖，在飲用牛奶后會(huì)發(fā)生腹瀉、腹脹（酸奶不會(huì)）。這是因?yàn)椴荒芟Ｄ讨械娜樘?，?半乳糖苷酶：又稱乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可連接生產(chǎn)低乳糖奶，已于1977年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。第五十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）在啤酒中

糖化需要α-淀粉酶，而麥芽中的α-淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶來(lái)補(bǔ)充，因此可將發(fā)酵液連續(xù)通過(guò)固定化淀粉酶反應(yīng)器。例如，在制造啤酒時(shí)，可以試用固定化微生物淀粉酶替代麥芽水解淀粉酶。另外，采用固定化蛋白質(zhì)分解酶類來(lái)水解蛋白質(zhì)或多肽也正在研究之中。啤酒經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間存放后，含有的多酚類和多肽結(jié)合在一起，產(chǎn)生所謂冷濁?，F(xiàn)在主要是應(yīng)用木瓜酶來(lái)防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，但長(zhǎng)期往啤酒中添加這類蛋白質(zhì)分解酶，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生不良影響。為克服這一缺點(diǎn)，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解決啤酒的防濁問(wèn)題。第五十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種，它可以用來(lái)催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖糖漿。自1972年這項(xiàng)技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，科學(xué)家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提取的葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，今后幾十年中它將是應(yīng)用最廣，市場(chǎng)份額最大的固定化酶。第五十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（4）在油脂改性中的應(yīng)用脂肪酶可以催化酯交換、酯轉(zhuǎn)移和水解等反應(yīng)，所以在油脂工業(yè)中有廣泛應(yīng)用，1，3-特異性脂肪酶可酶促酯交換反應(yīng)，將棕櫚油改性為可可酯。代可可酯是生產(chǎn)巧克力的原料，價(jià)格甚高，而棕櫚價(jià)廉，因此這一工藝受到較大重視，已開(kāi)展了較多工作。第五十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（5）用固定化酶酶促生產(chǎn)阿斯巴甜阿斯巴甜是雙肽甜味劑，在工業(yè)上用化學(xué)法合成?，F(xiàn)在，已開(kāi)始用酶法合成，用固定化酶進(jìn)行藕合反應(yīng)，得到阿斯巴甜。第五十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（6）固定化酶在茶葉加工中的應(yīng)用。

目前，固定化酶法已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于茶飲料中，例如，固定化的單寧酶和果膠酶。單寧酶是一種水解酶，可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵。將單寧酶應(yīng)用于茶葉飲料可以改善茶飲料的品質(zhì)。據(jù)報(bào)道用固定化的單寧酶處理紅茶，可提高茶湯中可溶性鐵和鈣的含量。若在綠茶加工中使用單寧酶，可以部分消除夏秋茶苦澀味道，可提高茶飲料品質(zhì)。果膠酶是作用于果膠質(zhì)的D-半乳糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，使高分子的聚半乳糖醛酸降解為小分子物質(zhì)。茶葉中的水溶性果膠與茶葉的品質(zhì)密切相關(guān)。第六十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（7）在果汁中的應(yīng)用柑橘類產(chǎn)品加工中出現(xiàn)苦味是柑橘加工中的重要問(wèn)題。造成苦味的物質(zhì)有兩類：一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物（A環(huán)和B環(huán)）；另一類為果實(shí)中的黃酮苷。脫苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物質(zhì)，而固定化酶法主要是利用不同酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工業(yè)上采用固定化柚皮苷酶減少柑橘類果汁中的柚皮苷含量。第六十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用（1）作為治療藥物固定化酶由于其高穩(wěn)定性，低免疫性，使其在作為治療藥物時(shí)，較之溶液酶，表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。

作為治療藥物，溶液酶具有一些“致命”弱點(diǎn)：

①酶作為異體物質(zhì)，反復(fù)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)②酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白酶水解破壞。③由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無(wú)法集中于靶器官組織以達(dá)到治療所需的最適高濃度。溶液酶的這些缺點(diǎn)，通過(guò)選擇適宜的載體與方法將它們固定化以后就能逐一地加以解決。第六十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）作為“人工臟器”

固定化酶可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)，其應(yīng)用主要有兩方面：

a.用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物

如清除尿毒癥病人體內(nèi)積累的尿素；進(jìn)行這類應(yīng)用時(shí)除了要考慮半壽期、免疫過(guò)敏等問(wèn)題外，還要在“人工臟器”中偶聯(lián)多種組成成分以徹底除去毒性產(chǎn)物。如處理尿素時(shí)，除了脲酶外，還要解決尿素分解生成氨的問(wèn)題，這就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的樹(shù)脂等。第六十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五b.除去(一種或多種)氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”治療時(shí)只需將患者的血液引出體外，通過(guò)由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再流回體內(nèi)。第六十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、生物傳感器生物傳感器是利用生物物質(zhì)作為識(shí)別元件將被測(cè)物濃度與可測(cè)量電信號(hào)關(guān)聯(lián)起來(lái)的裝置，生物傳感器中研究最多的是酶?jìng)鞲衅?，其核心技術(shù)也是酶的固定化。

Chen等將高聚物聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜將葡萄糖氧化酶固定在金電極上，通過(guò)檢測(cè)電信號(hào)可以測(cè)定血液中的葡萄糖含量。宋正華等將具有分子識(shí)別功能的β-葡萄糖苷酶和發(fā)光胺，分別固定在殼質(zhì)胺和大孔陰離子交換樹(shù)脂的填充柱中,組成流動(dòng)注射系統(tǒng)，可以方便地確定苦杏仁甙的含量。第六十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、環(huán)境保護(hù)固定化酶一個(gè)很大的用途是處理廢水中一些有毒有害物質(zhì)，防止污染。其中漆酶的固定化應(yīng)用較為廣泛，酚類化合物是廢水中一類常見(jiàn)的高含量污染物，漆酶可以催化氧化酚類化合物，而且不用加入過(guò)氧化物酶。在廢水處理中,由于組分復(fù)雜而且經(jīng)常變化，利用單一的固定化酶，很難收到好的處理效果。因此，要用多酶固定化體系組合處理，才能使有機(jī)物完全礦化和保持無(wú)害穩(wěn)定排放。第六十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二節(jié)細(xì)胞固定化一、基本概念二、細(xì)胞固定化方法三、固定化細(xì)胞的特點(diǎn)四、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用五、固定化植物細(xì)胞六、固定化動(dòng)物細(xì)胞第六十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五細(xì)胞固定化技術(shù)：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。固定化細(xì)胞

：被限定自由移動(dòng)的細(xì)胞，即采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。一、基本概念第六十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五固定化細(xì)胞與固定化酶相比，其優(yōu)點(diǎn)：①不需要破碎細(xì)胞和分離提純酶，減少了酶活力損失，可大大降低生產(chǎn)成本；②保持了胞內(nèi)酶系原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而酶更穩(wěn)定；③保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，能催化一系列的反應(yīng)，大大提高了催化效率，特別是對(duì)那些多酶反應(yīng)、需要輔酶的氧化還原反應(yīng)以及合成反應(yīng)等，固定化細(xì)胞更具有明顯的優(yōu)勢(shì)；④固定化細(xì)胞的制備與使用通常都比固定化酶更簡(jiǎn)便。第七十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、微生物細(xì)胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法和無(wú)載體法。1、吸附法(1)定義：將細(xì)胞直接與水不溶性載體相結(jié)合的方法。(2)常用吸附劑：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。(3)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝沒(méi)有明顯的影響。

缺點(diǎn)：吸附力弱，吸附容量小，沒(méi)有工業(yè)化生產(chǎn)。第七十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、包埋法（最常用）：

(1)定義：將細(xì)胞包埋于多孔載體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法，稱為包埋法，包埋法能保持多酶系統(tǒng)，是目前制備固定細(xì)胞最常用的方法。包埋法又分為凝膠包埋法和半透膜（膠囊）包埋法。第七十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(2)凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將細(xì)胞包埋在凝膠的微孔內(nèi)，而使細(xì)胞固定化的方法。凝膠包埋法常用載體有：瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠等。

a.瓊脂凝膠包埋法b.海藻酸鈣凝膠包埋法

c.角叉萊膠包埋法d.明膠包埋法

e.聚丙烯酰胺凝膠包埋法(3)半透膜膠囊包埋法：將細(xì)胞分散于有機(jī)溶劑中成乳化液，此時(shí)，細(xì)胞被一層液態(tài)膜包圍，形成具有半透膜膠囊的固相細(xì)胞。第七十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五瓊脂凝膠包埋法瓊脂＋水溶化冷卻至48～55℃

加菌懸液

趁熱分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞膠粒。攤成薄層，冷卻，切成所需形狀。

瓊脂凝膠機(jī)械強(qiáng)度較差，氧氣、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散較困難，其使用受到限制。第七十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五海藻酸鈣凝膠包埋法海藻酸鈉水溶液＋滅菌菌懸液

滴入氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞膠粒。

海藻酸鈣凝膠包埋法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，通過(guò)改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑，適合于多種細(xì)胞的固定化。

磷酸鹽會(huì)使凝膠結(jié)構(gòu)破壞，使用時(shí)應(yīng)控制好培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度，并在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。第七十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五角叉菜膠包埋法角叉菜膠水溶液冷卻至35～50℃

加菌懸液

趁熱滴定至KCl溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞膠粒。滴到冷的植物油中，成型后再置于KCl溶液中。角叉萊膠具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。若使用濃度較低，強(qiáng)度不夠時(shí)，可用戊二醛等交聯(lián)劑再交聯(lián)處理，進(jìn)行雙重固定化。滅菌第七十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五明膠包埋法明膠水溶液冷卻至35℃以上

加菌懸液

冷卻后制成所需形狀。機(jī)械強(qiáng)度不夠時(shí)，可用戊二醛等交聯(lián)劑再交聯(lián)處理，進(jìn)行雙重固定化。滅菌第七十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五聚丙烯酰胺凝膠包埋法丙烯酰胺＋甲叉雙丙烯酰胺混合加過(guò)硫酸鈣和四甲基乙二胺靜置成型固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度高，可通過(guò)改變丙烯酰胺的濃度以調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，適用于多種細(xì)胞和酶的固定化。＋菌懸液

注意：丙烯酰胺單體對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，在聚合過(guò)程中，應(yīng)盡量縮短聚合時(shí)間，以減少細(xì)胞與丙烯酰胺單體的接觸時(shí)間。第七十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、無(wú)載體法

(1)基本概念：在沒(méi)有載體的情況下，借助物理或化學(xué)方法，將細(xì)胞直接固定化的方法。這種固定化，既可發(fā)生在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，也可通過(guò)細(xì)胞聚集來(lái)完成。包括去自溶酶法和絮凝法。第七十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(2)去自溶酶法：細(xì)胞所具有的酶系，從廣義上講已是一種固相酶，因此用簡(jiǎn)單的加熱、凍凍，β-射線幅射等物理手段處理細(xì)胞，使細(xì)胞的自溶酶系失活，防止目的酶被水解，由此得到的細(xì)胞實(shí)體，為固相細(xì)胞。第八十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

(3)絮凝法：向待固定的細(xì)胞液中加入絮凝劑，使細(xì)胞凝聚在一起，過(guò)濾，收集絮凝細(xì)胞，裝柱，即為可使用的固相細(xì)胞。

常用絮凝劑：活性硅膠、聚賴AA、聚丙烯酰胺等。

第八十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五目前已報(bào)道的有絮凝性的微生物有：霉菌（赫曲霉、醬油曲霉、米曲霉）放線菌（灰色鏈霉菌、酒紅鏈霉菌、石灰壤諾氏卡菌、椿象蟲(chóng)諾卡氏菌）細(xì)菌（嗜蟲(chóng)短桿菌、產(chǎn)堿細(xì)菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、紅平紅球菌、金黃色葡萄球菌及運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌）酵母菌（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂殖酵母、異常漢遜酵母等）第八十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、固定化微生物細(xì)胞的特點(diǎn)：（1）保持了其完整結(jié)構(gòu)和自然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。（2）細(xì)胞密度增大，能夠提高產(chǎn)物產(chǎn)率。（3）發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或者連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間。（4）保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶系和代謝調(diào)控體系，可以按照原理的代謝途徑進(jìn)行新陳代謝，并進(jìn)行有效的代謝調(diào)節(jié)控制。（5）提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性，有利于菌種的傳代保存。第八十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用1、利用固定化微生物細(xì)胞生產(chǎn)各種產(chǎn)物：固定化微生物細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，繁殖和新陳代謝，所以利用固定化細(xì)胞可以如同游離細(xì)胞那樣發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝物。由于微生物固定化后，受載體的影響，故固定化微生物只用于生產(chǎn)各種能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物。

其中主要有下面幾類物質(zhì)：第八十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(1)酒精酒類：固定化酵母等微生物可用于生產(chǎn)酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒等。有的已完成中試，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。(2)氨基酸：固定化氨基酸生產(chǎn)菌可用于生產(chǎn)谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、異亮氨酸等氨基酸。(3)有機(jī)酸：固定化黑曲霉等微生物可生產(chǎn)蘋(píng)果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有機(jī)酸。第八十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

(4)酶和輔酶：固定化微生物可用于生產(chǎn)α—淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、磷酸二酯酶、天門(mén)冬酰氨酶等胞外酶．以及輔酶A，NAD，NADP、ATP等輔酶．

(5)抗生素：固定化微生物在生產(chǎn)青霉素，四環(huán)素，頭孢霉素、桿菌肽、氨芐青霉素等抗生素方面的研究，成果顯著。

(6）固定化微生物細(xì)胞還可以用于甾體轉(zhuǎn)化及有機(jī)溶劑、維生素、化工產(chǎn)品等的生產(chǎn)。第八十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、固定化微生物細(xì)胞制造微生物傳感器：

微生物傳感器是由固定化微生物細(xì)胞與各種能量轉(zhuǎn)換器(電極，燃料電池，場(chǎng)效應(yīng)管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置。微生物傳感器分為呼吸活性測(cè)定型和電極活性測(cè)定性兩種。第八十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五呼吸活性測(cè)定型：

利用固定在高分子膜上的微生物細(xì)胞的呼吸作用，測(cè)定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測(cè)定物質(zhì)的量。這種呼吸活性測(cè)定型傳感器由固定化微生物膜和氧電極或二氧化碳電極結(jié)合而成。第八十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五

電極活性測(cè)定型：

利用固定的微生物細(xì)胞的新陳代謝作用，測(cè)定電極活性物質(zhì)的量的變化從而確定樣品中欲測(cè)物質(zhì)的含量，這種傳感器由固定化微生物膜與生物燃料電池、離子選擇電極和氣體電極等組成。

微生物傳感器已成功地用于測(cè)定可發(fā)酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、頭孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸鹽，生化需氧量(BOD)、細(xì)胞數(shù)量等。

第八十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、固定化植物細(xì)胞1、固定化植物細(xì)胞方法：主要為吸附法與包埋法。(1)吸附法：吸附法是將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁上。

第九十頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(2)包埋法：包埋法是將植物細(xì)胞包埋在瓊脂，角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細(xì)胞包埋時(shí)基本相同．此法已在植物細(xì)胞固定化，以及發(fā)酵生產(chǎn)次級(jí)代謝物方面廣泛采用。第九十一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、固定化植物細(xì)胞特點(diǎn)(1)提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性載體的保護(hù)可減輕剪切力和其他外界因素對(duì)植物細(xì)胞的影響．(2)固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡(jiǎn)便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，以利于生產(chǎn)各種所需的次級(jí)代謝物。第九十二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(5)固定化植物細(xì)胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)一段時(shí)間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。(4)固定化植物細(xì)胞易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。(3)細(xì)胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)，不容易聚集成團(tuán)。第九十三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、固定化植物細(xì)胞特點(diǎn)

固定化植物細(xì)胞主要用途是制造人工種子。還可以用于生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶等次級(jí)代謝物，一般僅適用于可以分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物的生產(chǎn)。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，則要想辦法增加細(xì)胞透過(guò)性，使胞內(nèi)產(chǎn)物分泌到胞外。第九十四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五第九十五頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五五、固定化動(dòng)物細(xì)胞1、動(dòng)物細(xì)胞固定化方法：主要為吸附法與包埋法

(1)吸附法：

大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中，必須趨向于附著在固體表面．故吸附法特別適合于動(dòng)物細(xì)胞的固定化。

操作簡(jiǎn)便、條件溫和，是動(dòng)物細(xì)胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附載體有轉(zhuǎn)瓶、微載體和中空纖維等。第九十六頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五a.轉(zhuǎn)瓶吸附：

轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過(guò)一定方法處理而帶上電荷。如用高錳酸鉀等氧化劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或紫外光照射等進(jìn)行表面處理，就可使動(dòng)物細(xì)胞容易附著在其表面生長(zhǎng)。

培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)瓶以一定速度轉(zhuǎn)動(dòng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，但比表面積(S／V，表面積與體積之比值)較小，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到限制。若在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)加進(jìn)列管或多層平板組成列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶即可使其比表面積增加，提高生產(chǎn)能力。第九十七頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五b.微載體吸附：微載體是指顆粒細(xì)小的固定化載體．直徑一般為100～200um，相對(duì)密度接近l.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠，纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。

微載體已用于多種動(dòng)物細(xì)胞的固定化；用于生產(chǎn)β-干擾素，人組織纖溶酶原活化劑、白細(xì)胞介素以及各種疫苗等。第九十八頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五c.中空纖維吸附：

中空纖維由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纖維管壁是半透膜。

使用時(shí)，將動(dòng)物細(xì)胞置于纖維管外壁和外殼容器的內(nèi)壁之間，細(xì)胞附著在中空纖維外壁．培養(yǎng)液在中空纖維管內(nèi)流動(dòng)，各種營(yíng)養(yǎng)成分、溶解氧和代謝產(chǎn)物透過(guò)中空纖維膜進(jìn)行傳遞。第九十九頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五現(xiàn)在已有多種中空纖維培養(yǎng)器用于動(dòng)物細(xì)胞固定化。中空纖維固定化適用于動(dòng)物附著細(xì)胞，也適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。中空纖維培養(yǎng)器的缺點(diǎn)是：中空纖維成本較高，有時(shí)會(huì)發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。第一百頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(2)包埋法：一般適用于懸浮細(xì)胞。根據(jù)載體和方法的不同，有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。a.凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動(dòng)物細(xì)胞固定化，細(xì)胞被固定在凝膠的微孔中生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝，由于有載體的保護(hù)，動(dòng)物細(xì)胞有較好的穩(wěn)定性．可顯著提高其存活率。用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。第一百零一頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五瓊脂凝膠包埋法1~2.5%瓊脂糖溶化冷卻至37～38℃

加動(dòng)物細(xì)胞

降溫至1O℃左右，得到直徑為0.1～0.3mm的微球狀固定化細(xì)胞。海藻酸鈣凝膠包埋法海藻酸鈉水溶液＋滅菌動(dòng)物細(xì)胞

滴入氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞。血纖維蛋白包埋法血纖維蛋白原＋動(dòng)物細(xì)胞＋凝血酶

血纖維蛋白第一百零二頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五b.半透膜包埋法：

利用高分子聚合物形成的半透膜將動(dòng)物細(xì)胞包埋，形成微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。制備過(guò)程：采用海藻酸鈣～聚賴氨酸(ALG-PLL)包埋技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞先用海藻酸鈣凝膠包埋．制成直徑l～2mm的膠粒，再用聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜，然后將它泡在檸檬酸鈉溶液中，使海藻酸鈣凝膠溶解。便獲得由聚賴氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。第一百零三頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、固定化動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)(1)提高細(xì)胞存活率：

動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護(hù)作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時(shí)動(dòng)物細(xì)胞可附著在載體表面生長(zhǎng)，從而可顯著提高動(dòng)物細(xì)胞的存活率。第一百零四頁(yè)，共一百一十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(2)提高產(chǎn)率：動(dòng)物細(xì)胞固定化后，可先在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繁殖，使細(xì)胞在載體上形成最佳分布并達(dá)到一定