核酸分子雜交工程

核酸分子雜交工程

用一已知的DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知的核苷酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原理互相結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置和大小顯示出來。核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)核酸分子雜交的基本原理具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的條件（溫度及離子強度）下可以按堿基互補配對的原則退火形成雙鏈分子，由此可用來檢測核酸分子存在與否。實質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程基因克隆的篩選酶切圖譜的制作基因組中特定基因序列的定量和定性分析基因突變分析疾病的診斷核酸分子雜交應(yīng)用探針(probe)的概念

用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段第一節(jié)核酸探針及其標記一、核酸標記物及其選擇探針的種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針高度靈敏性標記物與核酸探針分子的結(jié)合，不影響探針的主要理化特性，絕對不能影響其堿基對特異性具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，能耐較高溫度和保存時間檢測方法具有高度特異性標記及檢測方法簡單對環(huán)境無污染，對人體無損傷價格低廉理想探針標記物應(yīng)具備的條件靈敏度極高放射性核素對各種酶促反應(yīng)無任何影響,也不會影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)極高的特異性1.放射性核素-----目前最常采用優(yōu)點缺點半衰期短,隨用隨標放射性污染無放射性污染穩(wěn)定性好,可較長時間存放2.非放射性標記物優(yōu)點缺點靈敏度不太高特異性不太高生物素地高辛熒光素：FITC，羅丹明非放射性標記物生物素化核苷酸的制備:酶法(U)與化學(xué)法(C)生物素標記方法:參入標記法(隨機引物法或缺口翻譯法)與光敏生物素標記法生物素探針的檢測體系①生物素探針+抗生物素蛋白+帶ALP或HRP的生物素+底物②生物素探針+抗生物素抗體+抗生物素抗體的抗體+ABC試劑(底物:BCIP+NBT)探針DNA標記:Dig+dUTP→Dig-dUTP

Dig-dUTP標記DNA方法:切口平移法與隨機引物標記法

檢測方法:Dig-DNA探針+抗Dig抗體-ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）二、核酸探針的標記方法DNA的切口平移標記法隨機引物標記法RNA探針的標記DNA的末端標記cDNA探針的標記寡核苷酸探針的標記1.DNA的切口平移標記法5′3′3′5′32P-部分標記的單鏈DNA片段切口原始位置切口最終位置32P-標記的DNA雙鏈DNA帶切口的雙鏈DNADNA聚合酶I[α-32P]-dCTP變性DNaseI，Mg2+dATP，dGTP，dTTP5′→3′外切1.DNA的切口平移標記法方法原始出處：RigbyPW,etal.LabelingdeoxyribonucleicacidtohighspecificactivityinvitrobynicktranslationwithDNApolymeraseI.JMolBiol,1977,113(1):237～251.2.KochJ,etal.AnimprovedmethodforlabellingofDNAprobesbynicktranslation.NucleicAcidsRes,1986,14(17):7132.

1.DNA的缺口平移標記法反應(yīng)體系變性模板1μgDNaseI大腸桿菌DNA聚合酶IdATP，dGTP，dTTP[α-32P]-dCTP，50μci/反應(yīng)總體積：50μl15℃，60min;95～100℃，2min冰浴驟冷比活：＞1×108cpm/μg2.DNA的隨機引物標記法5′3′3′5′32P-標記的單鏈DNA探針32P-標記的DNA雙鏈DNAKlenowDNA聚合酶[α-32P]-dCTP變性dATP，dGTP，dTTP3′5′隨機引物3′5′3′5′變性隨機引物隨機引物(六聚核苷酸,46=4096種)2.隨機引物標記法FeinbergAP,VogelsteinB.

AtechniqueforradiolabelingDNArestrictionendonucleasefragmentstohighspecificactivity.

AnalBiochem,1983,132(1):6

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13.方法原始出處：反應(yīng)體系變性模板25ngKlenow片段隨機引物(六聚核苷酸,46=4096種)dATP，dGTP，dTTP[α-32P]-dCTP，50μci/反應(yīng)總體積：50μlRT，60min;95～100℃，2min冰浴驟冷比活：＞1×109cpm/μg隨機引物標記法（4’51’’）3.RNA探針的標記（略）4.DNA的末端標記條件:5′-OH,人工合成的寡核苷酸最常用雙鏈的DNA則需用CAP切除5′-P后再標記5′pCpGpTpA……3′5′HO-CpGpTpA……3′T4噬菌體多核苷酸激酶γ-32P-ATP5′32pCpGpTpA……3′37℃，反應(yīng)10min,γ-32P-ATP需150μci/反應(yīng)(1)DNA的5′末端標記(2)DNA的3′末端標記5′3′3′5′完整雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶5′3′3′5′[α-32P]-dNTP其他3種dNTPKlenowDNA聚合酶5′3′3′5′變性5′3′3′5′5′末端突出的DNA3′末端標記的DNA32P-末端標記的單鏈DNA探針末端標記的DNAEcoR

I**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′POH—EcoRI:dTTP+[α-32P]-dATP根據(jù)酶切位點選擇同位素與非同位素dNTP

6.寡核苷酸探針的標記

(1)在DNA合成時加入特定標記的核苷酸進行標記

(2)上述末端標記法5.cDNA探針的標記

在反轉(zhuǎn)錄過程中選用反轉(zhuǎn)錄酶,加入標記的核苷酸,引物可以特定的,也可以是隨機六核苷酸,或oligodT。根據(jù)反應(yīng)原理

確定同位素反應(yīng)底物名稱DNA的缺口平移標記法隨機引物標記法DNA的3′末端標記●DNA的5′末端標記

均為延長核苷酸的反應(yīng)，而且要讓32P進入鏈中，故應(yīng)選擇[α-32P]-dNTP，50μci/反應(yīng)，無特殊原因首選[α-32P]-dCTP。為加磷酸反應(yīng)，而且要讓32P進入5′末端，故應(yīng)選擇[γ-32P]-ATP，150μci/反應(yīng)訂購?fù)凰?2P的地址100039北京市海淀區(qū)田村路80號北京福瑞生物醫(yī)學(xué)工程公司：每月2次訂貨，通過EMS送到收發(fā)室三、標記探針的純化

凝膠過濾層析

常用的凝膠基質(zhì)：SephadexG-50,Bio-GelP-60

選擇性沉淀乙醇存在，醋酸銨可起此作用第二節(jié)核酸分子雜交的種類與方法液相雜交固相雜交（最常用）原位雜交印跡雜交Southern雜交Northern雜交一、固相支持物與印跡方法的選擇膜印跡雜交成敗的關(guān)鍵：選擇良好的固相支持物有效的轉(zhuǎn)移方法固相支持物------膜的種類：硝酸纖維膜（NC）膜尼龍膜聚二氟乙烯（PVDF）膜印跡方法的選擇目前常用的印跡轉(zhuǎn)移的方法：毛細管轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移

現(xiàn)在主要使用帶電荷的尼龍膜作為電轉(zhuǎn)移的DNA支持載體完全轉(zhuǎn)移所需的時間取決于：DNA片段的大小凝膠的孔隙度外加電場的強度真空轉(zhuǎn)移使用真空轉(zhuǎn)移裝置可快速并定量轉(zhuǎn)移NC膜或尼龍膜均可真空印跡系統(tǒng)(Bio-Rad)10×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500gNC膜或尼龍膜毛細管轉(zhuǎn)移Whatman濾紙凝膠雜交膜封口膜(parafilm)Whatman濾紙紙巾液流向下的毛細管轉(zhuǎn)移裝置示意圖二、Southern印跡雜交SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis.

JMolBiol，1975,98(3):503-517.原始文獻出處：

限制性內(nèi)切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉(zhuǎn)印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預(yù)雜交、雜交→放射性自顯影定義Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過特異性探針的雜交來檢測被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。程序基本原理-------------毛細管轉(zhuǎn)移Southern印跡雜交法M1212與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜10×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500gNC膜或尼龍膜常用的實驗條件的選擇封閉探針在濾膜表面上的非特異性結(jié)合試劑有：Dehardt試劑，肝素和脫脂奶粉。5×Dehardt(Ficoll0.1gPVP0.1g,BSA0.1g),0.5%SDS,100μg/ml鮭精DNA混合試劑比較常用。0.25%脫脂奶粉(0.05×BLOTTO)也較常用。Dehardt試劑用于尼龍膜更為有效.雜交爐雜交爐雜交爐雜交爐三、Northern印跡雜交AlwineJC,etal.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paperandhybridizationwithDNAprobes.ProcNatlAcadSciUSA,1977,74(12):5350-5354原始文獻出處名稱相對于SouthernblotNorthern印跡雜交程序

將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。（一）實驗準備（二）制備凝膠（三）樣品的處理（四）RNA電泳（五）RNA的轉(zhuǎn)移Northern與Southern印跡雜交異同點相同點：基本