聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳

聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳第一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五2、基本原理2.1蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì).在不同的pH環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷不同。若在某特定的pH環(huán)境中其凈電荷為零,此時(shí)的pH為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在電場(chǎng)下不泳動(dòng)。第二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五2.2.等電聚焦在常規(guī)電泳中,通常只是在恒定的緩沖液中進(jìn)行分離，假定有A,B兩個(gè)蛋白質(zhì)組分，分別帶有凈電荷-3和+1。在一個(gè)pH9的緩沖洗脫中,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)均放在靠陰極一側(cè)電泳,此時(shí)帶負(fù)電荷多的A蛋白質(zhì)受陽極影響大,泳動(dòng)速度比B快,最終會(huì)超過B，這樣二者就會(huì)得到分離。在等電聚焦電泳中，分離是在連續(xù)的pH梯度中進(jìn)行的。如果把A,B二者的混合物放在一個(gè)pH3.5-10的pH梯度中的pH6的位置，則A蛋白質(zhì)的凈電荷為-2,減少兩個(gè)凈電荷；B蛋白質(zhì)的凈電荷為+2，多了兩個(gè)凈電荷。在相同的電場(chǎng)下,A移向陽極,B移向陰極，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，這種行為稱為聚焦反應(yīng)。第三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點(diǎn)，這是一個(gè)”穩(wěn)態(tài)”過程,一旦達(dá)到等電點(diǎn)的位置，蛋白質(zhì)就會(huì)停止遷移。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的pH制約，即若向負(fù)極擴(kuò)散帶負(fù)電,會(huì)受到陽極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位;若向正極擴(kuò)散帶正負(fù)電,會(huì)受到陰極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。第四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五2.3.兩性電解質(zhì)(1)Ampholine(瑞典LKB)它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,pH范圍2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.第六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(2)Servalyte(德國(guó)Serva公司)它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)合成的.pH范圍:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.第七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(3)Pharmalyte(瑞典Pharmacia)七氨基多羧基組成的pH范圍:2.5-5,4-5.5,5-8,8-10,3-10等第八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(4)載體兩性電解質(zhì)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)合成的方式與Ampholine基本相同.pH范圍:3-9.5,3.5-5.5,4.0-6.0,5.0-7.0,6.0-9.0,7.0-10.0第九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五3pH梯度的形成3.1在電場(chǎng)下載體兩性電解質(zhì)的變化在沒有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等,凈電荷為零.引入電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動(dòng),最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.第十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陽極順延。如圖第十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五第十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五3.2pH梯度的形成過程pH梯度形成的時(shí)間,視正負(fù)電極之間的距離和凝膠的厚度而定.一般一塊長(zhǎng)12cm的玻璃,電極間的有效距離為10cm，凝膠的厚度為1mm，使用Ampholine為載體兩性電解質(zhì),電泳1小時(shí)后pH梯度基本形成，2小時(shí)后無多大變化,如圖第十三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五第十五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五4、實(shí)驗(yàn)流程等電聚焦凝膠溶液配制↓安裝電泳槽、調(diào)水平↓鋪膠↓加樣↓電泳↓停止電泳↓取膠固定↓染色、脫色第十六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五二、實(shí)驗(yàn)方法1、儀器準(zhǔn)備及清洗(1)電泳槽,玻璃板三塊,塑料模板(2)燒杯50ml一個(gè)(3)量筒100ml一個(gè)10ml一個(gè)(4)大培養(yǎng)皿一個(gè)第十七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五2、配試劑(每組用量)（1）固定液100ml三氯乙酸10g磺基水楊酸3.5g95%乙醇35ml加蒸餾水至100ml(2)脫色液100ml95%乙醇10ml

冰醋酸7.5ml加蒸餾水至100ml第十八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五3、實(shí)驗(yàn)步驟(1)安裝電泳槽,調(diào)水平(先平放兩塊相同厚度玻璃板,上放塑料模板,一頭用鐵夾夾住)ABCDE第十九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(2)配凝膠溶液?jiǎn)误w2mlAmpholine0.5mlddH2O5.5mlTEMED8μl10%AP50μl第二十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(3)灌膠,聚膠60分鐘(4)取下玻璃板,電泳槽上加少許液體石蠟,將坐標(biāo)紙浸透鋪平整,坐標(biāo)紙上放帶膠玻璃板(5)加電極條:取4張濾紙條,其中兩張濾紙條浸透1mol/L磷酸,另兩張浸透1mol/LNaOH,多余的液滴用濾紙質(zhì)吸去,然后對(duì)稱放在凝膠的兩側(cè).第二十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(6)剪取加樣紙:按坐標(biāo)紙的尺寸,剪成0.5x0.5cm大小的加樣紙,撥去上下覆蓋的保護(hù)紙,取出8層擦鏡紙作為加樣紙,根據(jù)樣液濃度調(diào)節(jié)加樣紙的層數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)樣4層,其它樣液均為8層).(7)加樣:將加樣紙分別吸取樣液,成一字形排放在兩電極之間的凝膠中央.(8)連接電極:將電極線的插頭插入電極板的插孔內(nèi),蓋上電極板,使鉑金絲壓在電極條上.蓋上安全罩,接通冷凝水.第二十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期五(9)電泳:將電泳儀正極輸出端與磷酸電極條相連,負(fù)極輸出端與NaOH電極條相連,接通電源,60V恒壓15min,8mA恒流至電壓上升到550V,關(guān)閉電源,揭去加樣紙,然后在550V恒壓3小時(shí)左右,等電流降至接近于零,停止電泳.(10)固定:取出凝膠,浸泡在40ml的固定液中搖動(dòng)約30min,傾出固定液.再加入60ml的固定液過夜.(11)染色:傾出固定液,用蒸餾水漂洗一次,加入考馬斯亮藍(lán)R