質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程

一.尋找目的基因mRNA序列及CDS閱讀框（蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因序列）質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程1.選中CDS開發(fā)閱讀框（表達(dá)蛋白的序列）基因序列，共162個(gè)堿基；2.注意CDS特征，前段非編碼區(qū)如果太長，需要增加保護(hù)序列；后端非編碼區(qū)如果長，則說明CDS序列穩(wěn)定可用；質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程將查到的CDS序列粘貼至newDNAfile框中，選擇linear類型DNA，軟件即可自動(dòng)分析該段序列中的可能酶切位點(diǎn)質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程二.登錄找到質(zhì)粒的全序列質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程同樣將該質(zhì)粒序列粘貼至軟件中，比較目的基因和質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（即酶切位點(diǎn)）質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程1.質(zhì)粒選擇酶切位點(diǎn)的原則：目的基因上不能存在將要使用的酶的酶切位點(diǎn)，否則目的基因會被切掉；2.質(zhì)粒上選擇酶切位點(diǎn)應(yīng)該盡可能短，為將來其他可能的克隆預(yù)留位置，如本實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒選擇Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室也買了，可用：質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程選中目的基因序列，復(fù)制質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程在AflI后至BamHI前的序列插入目的基因序列，并選擇features給插入的目的基因命名UGT1A1質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程在目的基因的終止密碼子TGA前還需再加上HAtag標(biāo)簽（陽性對照蛋白，即質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并成功表達(dá)的話，該段蛋白必定存在，可用WB測出），標(biāo)簽序列登錄addgene官網(wǎng)查詢：質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程三.克隆引物設(shè)計(jì)1.電腦設(shè)計(jì)：回到NCBI的primerblast，拷貝目的基因CDS序列(共1602個(gè)堿基)，在框中輸入>|a|和CDS序列，并在Min和Max分別輸入1602（表示blastCDS全部基因）；質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程2.手工設(shè)計(jì)：遵循GC盡量少，Tm盡量小的原則，5端后選20個(gè)左右；3端從酶切位點(diǎn)終點(diǎn)往前數(shù)59個(gè)，因?yàn)槌DS框的20個(gè)堿基后還要包括HA位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)序列。質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程5端引物序列即為atggctgtggagtcccag，但是還要再加上一段保護(hù)堿基AAATATATCTTAAG最后可得Forwardprimer為AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct目的基因的20個(gè)堿基3端引物設(shè)計(jì)的起點(diǎn)（不含BamHI酶切位點(diǎn)）和方向質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程最后要把引物順序調(diào)整過來，點(diǎn)擊“5→3”既得Reverseprimer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct，同樣在5端位置需再加上一段保護(hù)堿基AAATATATGGATCC最后Reverseprimer序列為AAATATATGGATCCtcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct質(zhì)粒目的基因插入及引物設(shè)計(jì)流程構(gòu)建表達(dá)載體的一般流程：設(shè)計(jì)primer(如上所述，綜合考慮HA，CDS序列)→合成引物→選擇合適的樣本細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)的UGT1A1為肝臟中存在的一種藥物代謝酶，因此最好選擇肝臟細(xì)胞系），提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→用設(shè)計(jì)的primer擴(kuò)增目的基因（UGT1A1）→瓊脂糖凝膠電泳→切膠回收特異條帶→目的基因與質(zhì)粒酶切結(jié)合，轉(zhuǎn)染細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)→提取質(zhì)粒，測序判斷