代謝控制發(fā)酵基本技術(shù)應(yīng)用

代謝控制發(fā)酵基本技術(shù)應(yīng)用第一節(jié)：誘變

一、誘變的概念和程序誘變：就是利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體，使其中少數(shù)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起微生物的遺傳性狀發(fā)生變化，然后通過(guò)目的選擇標(biāo)記設(shè)法從群體中篩選出少數(shù)性狀優(yōu)良的突變菌株的過(guò)程。誘變程序：出發(fā)菌株純化制備菌體懸浮液誘變劑處理中間培養(yǎng)目的突變菌株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性試驗(yàn)二、誘變劑1．誘變劑的概念：能夠顯著地提高微生物突變頻率的理化因素2．誘變劑的種類：一般有下列兩大類：物理誘變劑：紫外線、X射線、r射線、快中子、激光、超聲波等?；瘜W(xué)誘變劑：亞硝酸、烷化劑、羥胺、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTC）、重氮化合物等3．紫外線誘變?cè)恚篋NA分子強(qiáng)烈吸收紫外線，可引起DNA的斷裂、DNA分子內(nèi)部和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、嘧啶水合作用及形成嘧啶二聚體等。誘變方法：(1)在誘變處理前，開啟紫外燈，預(yù)熱20min，使光波穩(wěn)定。(2)將10m1細(xì)胞懸浮液置于滅過(guò)菌的并帶有磁力攪拌棒的直徑的培養(yǎng)皿中，放置在磁力攪拌器的載物臺(tái)上，紫外線照射10min進(jìn)行培養(yǎng)皿的表面消毒(3)開啟磁力攪拌器，打開皿蓋(4)照射一定時(shí)間后，蓋上皿蓋，將培養(yǎng)皿取出，取1m1處理液稀釋涂平板或中間培養(yǎng)。4．亞硝酸誘變?cè)恚簛喯跛峥梢允箟A基氧化脫氨，使AH、CU、GX，從而改變了原來(lái)的堿基配對(duì)關(guān)系，引起突變。誘變方法：

(1)配制緩沖液及亞硝酸溶液滅菌備用。2)取細(xì)胞懸浮液2m1，加入2，加入醋酸緩沖液,27C保溫處理一定時(shí)間。(3)取2m1處理液，加入pH8.6的NaH2PO4溶液，調(diào)整PH值為7，誘變作用終止。(4)適當(dāng)稀釋后徐平板或進(jìn)行中間培養(yǎng)。5．烷化劑誘變?cè)恚和榛瘎┠芘c核苷酸分子中的磷酸基，堿基起烷化作用，或與DNA分子作用造成DNA的損傷。誘變方法：以硫酸二乙酯(DES)為例

(1)菌懸液制備將細(xì)菌接入肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集體，將細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液中，制成細(xì)胞濃度為108個(gè)／mI的菌懸液。(2)取4ml菌懸液，加入磷酸緩沖液，加入，30℃

處理一定時(shí)間。(3)取1m1處理液，放入20ml肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜或直接稀釋徐平板。三、誘變育種中的幾個(gè)問(wèn)題1．出發(fā)菌株的選擇A出發(fā)菌株應(yīng)對(duì)誘變劑敏感、變異幅度大。B利用野生型菌株。C選用經(jīng)自發(fā)突變篩選得到的菌株。D利用回復(fù)突變或基因重組后的菌株。E選擇單倍體細(xì)胞。F選擇單核或細(xì)胞核盡量少的細(xì)胞。2．細(xì)胞懸浮液的制備A同步培養(yǎng)。B選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。C細(xì)胞懸浮液：真菌孢子和酵母菌濃度為106個(gè)/ml，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和放線菌孢子濃度為108個(gè)/ml。D細(xì)胞懸浮液的制備：物理誘變劑用生理鹽水配制，化學(xué)誘變劑用緩沖液配制。3．誘變劑的選擇及處理方法的的選擇A誘變劑的選擇B誘變劑量的選擇C誘變處理方法的選擇4．中間培養(yǎng)突變基因的出現(xiàn)并不意味著突變表型的出現(xiàn)，表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象，稱為表型延遲。其原因有分離性延遲和生理性延遲兩種。為了克服表型延遲，必須將經(jīng)誘變處理的菌液進(jìn)行中間培養(yǎng)，即將一定量的菌液接入完全液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。四、突變型菌株的分離1．營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的分離A營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的濃縮目的：選擇性地除去經(jīng)中間培養(yǎng)后群體細(xì)胞中的野生型細(xì)胞方法：青霉素法、D-環(huán)絲氨酸法、五氯酚法、亞硫酸法、制霉菌素法、6-脫氧葡萄糖法、過(guò)濾法、差別殺菌法等。B營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出目的：檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株方法：逐個(gè)檢出法、夾層檢出法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法、影印接種法等C營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定目的：鑒定突變菌屬哪種物質(zhì)缺陷型方法：在基本培養(yǎng)基上放置含有氨基酸、維生素、核酸水解物的濾紙片，進(jìn)行培養(yǎng)。

逐個(gè)檢出法夾層檢出法影印接種法等2．抗性突變菌株的分離A抗藥性突變菌株的分離B結(jié)構(gòu)類似物抗性突變菌株的分離3．溫度敏感突變菌株的分離4．產(chǎn)量性狀突變菌株的分離第二節(jié)：原生質(zhì)體融合一、概念與流程概念：將兩個(gè)遺傳性狀不同的細(xì)胞融合為一個(gè)新細(xì)胞流程：篩選標(biāo)記菌株制備原生質(zhì)體

原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體融合融合子的選擇篩選實(shí)用菌株二、標(biāo)記菌株的篩選一般選營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗藥性等遺傳性狀作為遺傳標(biāo)記三、

原生質(zhì)體的制備A菌體前處理加入一些化學(xué)物質(zhì)，使菌體的細(xì)胞壁對(duì)酶的敏感性增加。B菌體的培養(yǎng)時(shí)間選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體。C酶濃度酶濃度過(guò)低，不利于原生質(zhì)的形成，酶濃度過(guò)高，導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率降低，必須選擇最適酶濃度D酶解溫度溫度高，有利于酶反應(yīng)速度；溫度增加，酶易變性失活。必須選擇最佳酶解溫度，一般在20-40℃。

E酶解時(shí)間時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞去壁完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶會(huì)對(duì)原生質(zhì)體發(fā)生作用，是細(xì)胞質(zhì)膜損傷，造成原生質(zhì)體破裂,從而使原生質(zhì)體失活，必須選擇合適的酶解時(shí)間。F滲透壓穩(wěn)定劑高滲透壓，保護(hù)原生質(zhì)體，有助于酶與底物的結(jié)合因此，一般采用滲透壓穩(wěn)定劑使其維持在高滲透壓條件。滲透壓穩(wěn)定劑有：細(xì)菌用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌用甘露醇、山梨醇等，霉菌用NaCl，KCl等。穩(wěn)定劑使用濃度在～。四、原生質(zhì)體的再生細(xì)胞破壁后得到的原生質(zhì)體應(yīng)具有再生能力，但由于已經(jīng)損失細(xì)胞壁，不能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，必須想辦法使其細(xì)胞壁生長(zhǎng)。再生培養(yǎng)基必須與原生質(zhì)體內(nèi)的滲透壓相等，因此再生培養(yǎng)基必須使用滲透壓穩(wěn)定劑。

五、

原生質(zhì)體融合僅將原生質(zhì)體等量混合，融合頻率很低。一般融合時(shí)使用融合促進(jìn)劑。融合促進(jìn)劑采用表面活性劑PEG（聚乙二醇）。影響原生質(zhì)體融合的因素主要有：1．融合劑濃度：PEG用量過(guò)低，原生質(zhì)體破裂，失去穩(wěn)定性；過(guò)高，原生質(zhì)體收縮而降低融合頻率，一般PEG用量為30-40%。2．融合時(shí)間：因PEG在高濃度下有毒，融合時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。3．陽(yáng)離子濃度：Ga2+濃度在為好，Na+、K+會(huì)降低融合頻率。4．

PH值：堿性條件能刺激產(chǎn)生最大融合頻率。5．紫外線：采用紫外線照射原生質(zhì)體再進(jìn)行融合，可大大提高融合頻率。六、融合子的選擇遺傳物質(zhì)融合后形成的細(xì)胞叫融合子。融合子有真正的融合，有暫時(shí)融合，前者穩(wěn)定。要獲得真正的融合子，必須在融合原生質(zhì)體再生后，進(jìn)行分離、選擇。融合子的選擇可采用，可采用鈍化法。

第三節(jié)：轉(zhuǎn)導(dǎo)

一、轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是利用轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA導(dǎo)入受體菌中，使受體菌獲得部分遺傳性狀的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的實(shí)現(xiàn)，必須有供體、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體、受體菌三部分存在。二、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法

1、制備轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體供體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入噬菌體繼續(xù)培養(yǎng)氯仿殺菌離心除菌體菌體裂解液轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體離心收集菌體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)第四節(jié)：轉(zhuǎn)化

一、轉(zhuǎn)化的概念從供給遺傳物質(zhì)的供體細(xì)胞中取出遺傳物質(zhì)，通過(guò)對(duì)接受遺傳物質(zhì)的受體細(xì)胞的培養(yǎng)處理，供體DNA片斷進(jìn)入受體內(nèi)，與受體細(xì)胞的DNA重組,從而使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀而獲得雜種的方法叫轉(zhuǎn)化育種二、轉(zhuǎn)化的方法1．

供體DNA的制備供體菌培養(yǎng)溶菌酶處理SDS、苯酚處理，使蛋白質(zhì)變性離心水相加冷乙醇DNA絮狀沉淀波棒取出供體DNA2．受體細(xì)胞對(duì)DNA的吸收

A將受體菌株在內(nèi)湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期、離心收集茵體，懸浮在等體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期，離心.B將菌體懸浮在等量或稍少的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí)，在試管中加入一定的DNA掖、受體菌液和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘，進(jìn)行轉(zhuǎn)化

C轉(zhuǎn)化后，按照一定的遺傳標(biāo)記在基本培養(yǎng)基中檢出，并作進(jìn)一步試驗(yàn)。

3．轉(zhuǎn)化過(guò)程與條件

A轉(zhuǎn)化過(guò)程細(xì)菌轉(zhuǎn)化大體過(guò)程是感受態(tài)的出現(xiàn)、DNA的吸附、DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、DNA解鏈、形成受體DNA—供體DNA復(fù)合物和DNA復(fù)制分離等幾個(gè)階段。其中感受態(tài)的出現(xiàn)是個(gè)重要的關(guān)鍵。

B感受態(tài)的出現(xiàn)細(xì)胞能從周圍環(huán)境吸取DNA分于使之不被DNA酶破壞時(shí)的細(xì)胞生理狀態(tài)稱為感受態(tài)。一個(gè)菌株能否出現(xiàn)感受態(tài)，不但由其遺傳特性決定，而且環(huán)境條件和細(xì)胞本身的生理狀態(tài)也起著作用。

CDNA吸附

DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞之前，要經(jīng)過(guò)可逆和不可逆的吸附?？赡嫖綍r(shí)，吸附了的DNA對(duì)DNA酶敏感，不可逆吸附時(shí)，雖然對(duì)DNA酶不敏感，但在DNA進(jìn)入細(xì)胞前，由于DNA吸附在細(xì)胞膜外面，若用溶菌酶處理，就會(huì)抑制轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞與DNA的親和性與DNA片斷大小有關(guān)。例如分子量從30萬(wàn)一800萬(wàn)的DNA，肺炎球菌細(xì)胞與最大分子量的DNA親和性最大，活性最高，分子量在30萬(wàn)以下就不表現(xiàn)轉(zhuǎn)化活性。

DDNA的摻入

DNA只能摻到感受態(tài)細(xì)胞中，一般是雙鏈DNA摻人，也有單鏈摻入的，這時(shí)的DNA活性較大。熱、冷、洗、溶菌酶等對(duì)DNA的摻入有一定的影響，DNA進(jìn)入細(xì)胞后，大部分在細(xì)胞膜上。

E供體DNA和受體DNA復(fù)合物的形成

DNA進(jìn)入細(xì)胞馬上取出，并不表現(xiàn)生物學(xué)活性，要經(jīng)過(guò)幾分鐘后才恢復(fù)其活性，并形成供體DNA和受體DNA的復(fù)合物。兩股單鏈都可以倂入受體DNA，但性狀的表現(xiàn)快慢有差別，倂人的DNA平均分子量約為2×106

。轉(zhuǎn)化育種的應(yīng)用目前尚不普遍，還有一定困難，主要是在可轉(zhuǎn)化的種屬中并不是所有菌株都可轉(zhuǎn)化。因此從非感受態(tài)細(xì)胞中建立一個(gè)獲得感受態(tài)細(xì)胞的簡(jiǎn)便有效方法很為登要。由于感受態(tài)是受多基因控制的，因此困難參一些，此外，還要注意DNA酶對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。當(dāng)然要提高轉(zhuǎn)化頻率，還要考慮合適的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件。第五節(jié)：雜交一、雜交的概念利用不同變種的細(xì)胞與細(xì)胞的結(jié)合、染色體的交換及基因重組來(lái)獲得優(yōu)良菌種的過(guò)程二、霉菌的雜交

霉菌雜交的過(guò)程實(shí)際上就是借助其準(zhǔn)性生殖循環(huán)過(guò)程中的基因重組和分離，把兩株具有不同優(yōu)點(diǎn)的菌種結(jié)合成一株新的菌種的過(guò)程。

1．親本的選擇作為青霉菌直接親本的遺傳標(biāo)記有多種：形態(tài)突變型、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗藥性突變型、抗生素產(chǎn)量突變型。當(dāng)前應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型最為普遍2．異核體的形成在基本培養(yǎng)基上，使兩營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株強(qiáng)迫互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)，則兩菌株經(jīng)過(guò)茵絲細(xì)胞間的吻合形成異核體，即在一條菌絲里含有兩個(gè)遺傳性狀不同的細(xì)胞核，共同生活在均一