第三章載體全章DHY版黑白版

第三章載體全章DHY版黑白版一、載體的概念

要把一個有用的外源基因通過基因工程手段送進(jìn)生物細(xì)胞中，需要運(yùn)載工具。這種能與目的基因結(jié)合，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞,且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的DNA大分子叫載體（Vector）。

第一節(jié)質(zhì)粒載體質(zhì)粒是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀(少數(shù)為線形和RNA）DNA分子。一、質(zhì)粒的一般特性(一)質(zhì)粒的分布及數(shù)量質(zhì)粒廣泛地分布于原核生物細(xì)胞中，也存在于某些真核細(xì)胞（酵母的2μ環(huán)狀質(zhì)粒）。一個細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)量變化也很大，有1至幾個的，也有幾十個的，甚至有數(shù)百個。這取決于質(zhì)粒的復(fù)制類型。(二)質(zhì)粒DNA的構(gòu)型三種不同的構(gòu)型：SC構(gòu)型（圖c)：超螺旋形態(tài)存在的共價閉合環(huán)形DNA(cccDNA)OC構(gòu)型)(圖b)：開環(huán)DNA(ocDNA)L構(gòu)型(圖a):線形DNA分子(三)質(zhì)粒DNA的生物學(xué)特性(1)寄生性：(2)穩(wěn)定性：(3)同源性：(4)重組性：

(5)不相容性：(6)傳遞性：(7)復(fù)制類型：(8)表現(xiàn)型：(四)質(zhì)粒的命名原則1976年提出pUC18plasmidUniversityofCalifornia編號二、構(gòu)建理想質(zhì)粒載體必須具備的條件(一)理想質(zhì)粒拷貝數(shù)較高(二)理想質(zhì)粒分子量較小(五)理想質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記(三)帶有盡可能多的單一限制性酶切位點(四)具有復(fù)制起始點(ori)lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO調(diào)控蛋白Pα-肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑IPTG常采用的標(biāo)記是對某種抗生素的抗性β-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)（α-互補(bǔ)或藍(lán)白斑篩選）。質(zhì)粒三、常用的質(zhì)粒載體“天然質(zhì)?！保簆SC101。pSC101質(zhì)粒載體是第一個成功用于克隆真核DNA的大腸桿菌天然質(zhì)粒載體。pSC101缺點：(一）克隆載體1、pBR322質(zhì)粒載體2、pUC質(zhì)粒載體3、pGEM質(zhì)粒載體pGEM系列與pUC系列之間的主要差別pGEM具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：BL21（DE3）。4、TA克隆載體

TaqDNA聚合酶可以在PCR產(chǎn)物的3’端加上一個非配對的脫氧腺嘌呤核苷（A）。根據(jù)這一特點研制出了一種線性質(zhì)粒，其5’端各帶一個不配對的脫氧胸腺嘧啶核苷（T），采用該質(zhì)粒可將PCR產(chǎn)物以TA連接的方式直接進(jìn)行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體稱為TA克隆載體。5、酵母中的2μm環(huán)質(zhì)粒酵母游離質(zhì)粒（yeastepisomalplasmids,YEps）酵母整合質(zhì)粒（）酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRps）：穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）pDB219

(二)表達(dá)載體基因表達(dá)(geneexpression)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子的過程。DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄pKK表達(dá)質(zhì)粒載體

pGEX融合表達(dá)載體系統(tǒng)QIAexpresspQE(6×His)表達(dá)系統(tǒng)一、噬菌體載體Bacteriophage(phage)；phagos

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒的總稱，個體微??；不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)；只含有單一核酸。

第二節(jié)其它載體1、噬菌體的生物學(xué)特性①對寄主功能的依賴性②保護(hù)自己的核酸分子免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的的破壞③將核酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞④產(chǎn)生大量的子代噬菌體顆粒⑤使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒2、噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類型結(jié)構(gòu)類型無尾部的二十面體型有尾部的二十面體型線狀體型核酸類型雙鏈線性DNA雙鏈環(huán)形DNA單鏈環(huán)形DNA單鏈線性DNA單鏈RNA3、噬菌機(jī)理噬菌斑(plaque)溶原性噬菌體溶原性細(xì)菌原噬菌體(prophage)二、λ噬菌體克隆載體1、λDNA

cos位點（cohesiveendsite）TACGGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA環(huán)化作用

除了兩個正調(diào)節(jié)基因N和Q之外，其余的是按功能的相近性聚集成簇的。例如，頭部、尾部、復(fù)制及重組四大功能的基因.

2、λ噬菌體的缺陷與改造

λ噬菌體的改造λ噬菌體的缺陷：3、λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù)

①λ噬菌體是一種溫和噬菌體②能承載比較大的外源DNA片段。③多種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點4、構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略①減少或增加酶切位點：②非必需區(qū)部分切除③可供選擇的標(biāo)記④體外包裝5、λ噬菌體克隆載體的主要類型兩種類型：置換型載體：插入型載體：6、λ重組體DNA的體外包裝1）相關(guān)概念轉(zhuǎn)染（Transfection）：重組噬菌體的體外包裝：

λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫構(gòu)建，也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。某種生物的一系列cDNA分子先通過置換或插入的方法與合適的λ噬菌體克隆載體重組，然后或者經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌細(xì)胞，或者不經(jīng)體外包裝直接轉(zhuǎn)染受體菌細(xì)胞。7、λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用

絲狀外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

分泌型6407個核苷酸至少有11個基因2700個外殼蛋白分子三、M13噬菌體載體M13噬菌體的基因組四、柯斯（cosmid）克隆載體1978年Collins和Hohn構(gòu)建“cossite－carryingplasmid”縮寫而成的人工構(gòu)建柯斯質(zhì)粒（cosmid）=cos序列+質(zhì)粒實際是質(zhì)粒的衍生物，它是用正常的質(zhì)粒同λ噬菌體的cos位點構(gòu)成。

pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI四、噬菌粒載體（phagemidvectors）

噬菌粒（phagemid）實際上是帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，六、

人工染色體克隆載體

人工染色體指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。酵母人工染色體酵母人工染色體（YAC)是人工染色體中能克隆最大DNA片段的載體，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。