免疫組化原理基礎

免疫組化原理基礎免疫組化原理免疫組化的原理

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。免疫組化原理基礎原理：組織或細胞內(nèi)的某種化學物質(zhì)（待檢測物）抗原

免疫動物

抗體檢測（免疫組織化學）

熒光素酶金、銀顆粒P-ERK：一抗：鼠來源的單克隆抗體.鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法免疫組化原理基礎三、免疫組化染色方法的類別直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）免疫組化原理基礎直接法將熒光、酶、金直接標記在一抗上進行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標記免疫組化原理基礎間接法將標記物標記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數(shù)幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差免疫組化原理基礎PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法組成：一抗是針對靶抗原的特異性抗體二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復合物三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復合物（PAP）免疫組化原理基礎PAP法

（過氧化酶-抗過氧化酶法）優(yōu)點：PAP復合物中含酶更多，且是一種非標記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片免疫組化原理基礎ABC法

（親和素-生物素法）組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復合物（親和素+酶標生物素）優(yōu)點：親和素和生物素有強大親和力，使其比直接和間接酶標法更敏感，也超過PAP法。能用于常規(guī)石蠟切片。免疫組化原理基礎親和素生物素酶親和素有四個生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高此生物反應的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中親和素—生物素復合物（ABC）免疫組化原理基礎LSAB（SP）法

標記的鏈霉親和素-生物素法特點：將HRP直接標記于鏈霉親和素上優(yōu)點：更快速：空間結(jié)構(gòu)更小更敏感：鏈霉親和素的親和性更強，更易于到達深部位點非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié)免疫組化原理基礎酶標親和素在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感免疫組化原理基礎一步法（EPOS）及兩步法（Envision）特點以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點操作簡便，省時提高了敏感性和特異性減少了背景著色避免內(nèi)源性生物素的干擾免疫組化原理基礎多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標記的多聚物免疫組化原理基礎辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應過程:HRP+H2O2HRP?H2O2

有色分子終末產(chǎn)物+HRP

DAB（電子供體）

HRP：酶

H2O2：底物

HRP?H2O2：酶?底物復合物受氫體為過氧化氫；供氫體較多包括DAB；

抗體抗原的結(jié)合是肉眼看不見的，顯色系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位，顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細顆粒沉淀DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法:DAB50mg0.1mPBS100ml30%H2O230-40ul免疫組化原理基礎PBS的PH和離子強度的使用免疫組化原理及流程介紹建議PH在濃度是中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。免疫組化原理基礎免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標法：利用標記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法：利用PAP復合物ABC法：利用AB復合物LSAB法:利用直接標記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)免疫組化原理基礎三免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.封閉內(nèi)源性過氧化物酶3.抗原修復、暴露抗原決定簇4.封閉非特異性蛋白5.一抗孵育

6.二抗孵育

7.SP反應

8.顯色9.復染、脫水、透明、封片

2.封閉內(nèi)源性過氧化物酶免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化脫蠟與水化的目的是確?？贵w等其它試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹2.封閉內(nèi)源性過氧化酶其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進行滅活。免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹3.抗原修復暴露抗原決定簇

由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。

抗原修復的主要方法:酶消化方法一般用于細胞內(nèi)抗原應用高頻電磁波打開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織切片上有些剩余的位點可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結(jié)合。

免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹5.一抗孵育一抗:可以特異結(jié)合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。免疫組化原理基礎一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關。一般37度1-2h，或4度過夜和從冰箱拿出后常溫復溫45min。免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標記(如帶熒光、放射性、化學發(fā)光或顯色基團），作用是檢測一抗。免疫組化原理基礎二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理基礎反應SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白生物素過氧化酶連接法。該法是ABC法基礎上的進一步改良。免疫組化原理基礎免疫組化原理及流程介紹8.顯色

在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化學基團的顯色作用，是復合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。免疫組化原理基礎1,鹽酸酒精:使用濃度1%36-38%鹽酸：1ml7