CGGBP1蛋白在大腸桿菌中的表達及其純化

CGGBP1蛋白在大腸桿菌中的表達及其純化

【關鍵詞】CGGBP1；基因表達；純化

0引言

脆性X綜合征是一種最常見的遺傳性智力發(fā)育不全綜合征，有超過99%的FXS是由脆性X智障基因1中5′端非編碼區(qū)CGG三核苷酸重復序列不穩(wěn)定擴增及其CpG島異常甲基化導致.FMR1基因的表達產物FMRP的缺乏導致FXS的發(fā)生［1-2］.本實驗對編碼基因存在于3號染色體［3］，能與FMR1基因5′d(CGG)n3′重復序列特異性結合的蛋白CGGBP1進行原核表達，并對其DNA結合活性進行研究.

1材料和方法1材料

大腸桿菌DH5α,BL21和表達載體pRSETA均為本實驗室保存.質粒提取試劑盒購自Sigma公司；限制性內切酶BamHI和KpnI購自寶生物工程公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；Ni2+NTA金屬螯合蛋白質純化系統購自Qiagen公司；鏈酶親和素磁珠購自Dynal公司；低分子質量蛋白標準購自上海西巴斯生物技術有限公司.

方法

表達載體的構建

根據CGGBP1基因起始密碼子和終止子鄰近序列設計PCR引物：CGGBP1FCGCGGATCCGAGCGATTGTAGTAACAGCA，CGGBP1RGGGGTACCTCAACAATCTTGTGAGTTGAG.其上游及下游引物分別加入BamHI和KpnI酶切識別位點序列(引物序列下劃線部分).PCR反應以人淋巴細胞cDNA文庫為模板，擴增編碼CGGBP1的基因序列.設計PCR擴增體系25μL，滅菌去離子水10μL，10×反應緩沖液μL，25mmol/LMgCl2μL，DMSOμL，4×dNTP混合物2μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10pmol，模板μL，TaqDNA聚合酶μL.擴增條件：95℃預變性5min，再94℃30s，53℃1min，72℃1min循環(huán)40次，最后72℃終末延伸產物10min.PCR產物經瓊脂糖電泳分離，用膠回試劑盒回收目的基因.用BamHI和KpnI酶切PCR產物和pRSETA，酶切產物電泳后回收，在Ｔ4連接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSETA的BamHI和KpnI克隆位點.將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α，接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板并挑取單菌落.融合蛋白的誘導表達

將測序正確的重組質粒轉入BL21.挑取攜帶目標質粒的單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h，按10mL/L比例轉接于新鮮培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，32℃誘導振蕩培養(yǎng)4h，離心收集菌體，SDSPAGE分析重組蛋白的表達.蛋白表達形式的分析

取5mL菌液離心，用500μL的裂解液重懸，加溶菌酶至終濃度為1mg/mL，冰浴30min，超聲波裂菌，離心后分別將上清和沉淀進行SDSPAGE分析.融合蛋白的純化

將1mL500mL/LNi2+NTA懸液和4mL細菌裂解上清液輕輕混勻4℃放置60min，直接過柱.過柱結束后，用4mL漂洗液，洗脫未和Ni珠結合的雜蛋白.經過2次漂洗后再用mL洗脫液(250mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl及50mmol/L磷酸二氫鈉pH)3次洗脫特異結合的目的蛋白，分步收集.取收集液，進行SDSPAGE分析.與29重復序列雙鏈DNA結合

實驗取10μL磁珠用1mL的無RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐劑.1×生物素親和素結合緩沖液15μL重懸磁珠，各5μL分3組實驗.其中一組加入25μL生物素化的29重復序列雙鏈DNA，另外兩組分別加入25μL非生物素化的29重復序列雙鏈DNA和25μL三蒸水做對照；三組分別再加入2×生物素親和素結合緩沖液30μL，25℃輕搖1h.經磁力吸附后，棄上清.重復上述步驟3次；加入純化后CGGBP115μL和2×核酸蛋白結合緩沖液20μL，室溫下靜置30min；經磁力吸附后，棄上清；用1×核酸蛋白結合緩沖液清洗磁珠2次；加三蒸水10μL，沸水煮10min，進行SDSPAGE分析.

2結果

原核表達載體的構建及鑒定

擴增產物在15g/L的瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到一條約504bp的條帶；重組質粒pRSETA/CGGBP1及質粒pRSETA分別用BamHI和KpnI酶切，pRSETA/CGGBP1分為兩個片段，分別為ku和504bp，均與預計結果相同.

的表達

用BamHI和KpnI雙酶切pRSETA/CGGBP1表達質粒，篩選陽性重組質粒.攜帶有pRSETA/CGGBP1質粒的BL21(DE3)菌株，經IPTG誘導后，在Mr約25000處出現1條表達條帶；而未經IPTG誘導的菌體則無此條帶.誘導后的菌體經溶菌酶及超聲波裂解，離心后分為上清和沉淀兩部分.經SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于細菌裂解液的上清中，為可溶性蛋白，上清液中的目標蛋白相對較少.

3CGGBP1蛋白純化

在表達質粒pRSETA多克隆酶切位點的上游，插入有連續(xù)6個組氨酸的序列—(His)6tag.重組質粒經誘導表達后，(His)6tag可以和外源插入片段共同表達.利用(His)6tag和金屬Ni2+的螯合所設計的固定化金屬配體親和柱層析方法，是純化目的蛋白的一種高效而簡單的方法.SDSPAGE顯示，CGGBP1得到較高程度的純化.

與5′d293′重復序列

雙鏈DNA結合實驗生物素化的5′d293′重復序列雙鏈DNA被固定到鏈酶親和素磁珠上，非生物素化的5′d293′重復序列雙鏈DNA因無法固定到鏈酶親和素磁珠上而被洗脫掉.同理，加入CGGBP1后，未和5′d(CGG）293′重復序列雙鏈DNA結合的蛋白也被洗脫.

3討論

關于微衛(wèi)星的產生機制，普遍認為是DNA復制過程中DNA聚合酶的滑動［4］，或DNA復制和修復時滑動鏈與互補鏈堿基錯配，導致一個或幾個重復單位的插入或缺失.已發(fā)現微衛(wèi)星可能是一種非?；钴S的堿基序列，通常各種簡單的重復序列成簇地聚集在一個染色體區(qū)域，這個染色體區(qū)形成特異染色體結構的能力將會增強.這些區(qū)域在核糖體RNA基因中非常復雜，同時這些重復序列所折疊形成的結構還能與特異的蛋白質相結合，成為“染色質折疊密碼”［5-6］，參與遺傳物質的結構改變，基因調控及細胞分化等過程.脆性X綜合征是Igarashi等［7］研究報道的與三核苷酸重復片段擴增突變有關的7種神經變性疾病其中的一種.該蛋白只和n重復序列發(fā)生特異性結合，而與其它類型的三核苷酸重復序列不結合［8］.因此，對該蛋白功能的研究具有重要的理論研究意義.

本實驗成功地構建了含CGGBP1的重組質粒，以可溶性蛋白形式獲得較高表達.通過Ni2+NTA柱純化，獲得純化的目標融合蛋白質，同時證明了該蛋白能和人FMR1基因5′d(CGG)293′重復序列雙鏈DNA特異性結合.這將為進一步開展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和闡釋CGG三核苷酸動態(tài)突變的致病機理奠定基礎.

【參考文獻】

［1］WellsRD,WarrenST.GeneticInstabilitiesandHereditaryNeurologicalDisorders［M］.AcademicPress,SanDiego,1998:46-96.

［2］ClearyJD,NicholK,WangYH,etal.Evidenceofcisactingfactorsinreplicationmediatedtrinucleotiderepeatinstabilityinprimatecells［J］.NatGenet,2002,31(1)：37-46.

［3］DeisslerH,WilmM,GencB,etal.RapidproteinsequencingbytandemmassspectrometryandcDNAcloningofCGGBP1［J］.BiolChem,1997,272(27):16761-16768.

［4］SindenRR,PotamanVN,OussatchevaEA,etal.TripletrepeatDNAstructuresandhumangeneticdisease:DynamicmutationsfromdynamicDNA［J］.Bioscience,2002,27(1Suppl1):53-65.

［5］WahlsWP.Meioticrecombinationhotspots:ShappingthegenomeandinsightintohypervariableminisatelliteDNAchange［J］.CurrTopDevBio1,1998,37:37-75.

［6］WahlsWP,MoorePD.RecombinationhotspotactivityofhypervariableminisatelliteDNArequiresminisatelliteDNAbindingproteins［J］.SomatCellMolGenet,1998,24(1):41-51.

［7］IgarashiS,TsujiS.ThemolecularmechanismsoftheinstabilityoftheCAGrepeat［J］.NipponRinsho,1998,56(4):1064-1073.