微生物培養(yǎng)技術(shù)

關(guān)于微生物培養(yǎng)技術(shù)第1頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三微生物非細(xì)胞生物：病毒原核生物：細(xì)菌、放線菌、支原體、立克次氏體真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）第2頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第3頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌的營養(yǎng)類型

根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)型:異養(yǎng)型:腐生菌寄生菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌第4頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)（3項(xiàng)技術(shù)1個案例）

（一）培養(yǎng)基配制技術(shù)（二）無菌技術(shù)（三）接種技術(shù)

案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)

第5頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三1、培養(yǎng)基定義：（課本第2頁）2、營養(yǎng)構(gòu)成：環(huán)境條件：pH、氧氣、二氧化碳、滲透壓等

（一）培養(yǎng)基配制技術(shù)營養(yǎng)成分：水、無機(jī)鹽、碳源、氮源、生長因子第6頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運(yùn)動液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)基的分類第7頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基（課本第2頁）斜面培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中需加入凝固劑，如瓊脂第8頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三半固體培養(yǎng)基無運(yùn)動有運(yùn)動

半固體培養(yǎng)基中也需要加入凝固劑瓊脂，但加入量少于固體培養(yǎng)基。第9頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三液體培養(yǎng)基表面生長均勻混濁生長沉淀生長第10頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三選擇培養(yǎng)基（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:抑制細(xì)菌和放線菌的生長，分離酵母菌、霉菌等真菌。

不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌定義（課本第7頁）舉例：加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌第11頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。

例如：在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別大腸桿菌。如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈藍(lán)紫色，并帶有金屬光澤。

(課本15頁)第12頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三

用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成的，因成分明確，常用于分類、鑒定等合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：（3）按成分分：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基

用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成的，如血清、組織提取液等第13頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱量時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。4.培養(yǎng)基的配制步驟（第8頁）（1）.計算:根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計算配制100mL的培養(yǎng)基時，各種成分的用量。（參考課本83頁培養(yǎng)基配方）（以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例）第14頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（2）.溶化：①加水加熱熔化牛肉膏

將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯加入少量的水，加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。②加入蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。

整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。（3）.調(diào)節(jié)pH（4）.分裝、包扎（5）.滅菌（6）倒平板第15頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。倒平板①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。第16頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三倒平板技術(shù)第17頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（二）無菌技術(shù)

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。１、消毒（1）定義：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）

第18頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6minB、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min

或80℃下煮15minC、化學(xué)藥劑消毒法:用酒精進(jìn)行皮膚消毒;

氯氣消毒水源D、射線消毒法（2）消毒的方法：第19頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（1）定義：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。2、滅菌（2）滅菌的方法：A、灼燒滅菌第20頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三C、高壓蒸汽滅菌：

100kPa、121℃下維持

15-30min.B、干熱滅菌：

160-170℃下加熱1-2h。第21頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（三）接種技術(shù)（課本第2頁）1.定義2.平板培養(yǎng)基上接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法

平板劃線的操作方法連續(xù)劃線法交叉劃線法第22頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三稀釋涂布平板法

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。第24頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第25頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第26頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三1、微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序（1）器具的滅菌（2）培養(yǎng)基的配制（3）培養(yǎng)基的滅菌（4）倒平板（5）微生物接種（6）恒溫箱中培養(yǎng)（7）菌種的保存（四）案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)第27頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三

（1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)步驟第28頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（2)配制培養(yǎng)基：計算稱量；熔化；調(diào)PH；分裝；滅菌；倒平板（3）接種：平板劃線法；稀釋涂布平板法。（4）培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，12和24h。（5）純化培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，24h。（6）菌種保藏：臨時、長期保存法。第29頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三菌種的保存

1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。

2、長期保存：甘油冷凍管藏法-20℃冷凍箱保存第30頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三二、培養(yǎng)基對微生物的選擇作用第31頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（一）、基礎(chǔ)知識1、纖維素與纖維素酶【案例】分解纖維素的微生物的分離纖維素是一種多糖纖維素酶是一種復(fù)合酶纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶第32頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（二）、篩選1、方法：剛果紅染色法原理：剛果紅（CR）可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)

以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第33頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三常用的剛果紅染色法有兩種方法一：在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋1mg/mL的CR

溶液，10—15min后，倒去CR溶液，加入

1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液。方法二：配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的CR溶液，滅菌后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入

CR溶液，混勻后倒平板。一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅第34頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（1）土壤取樣（2）選擇培養(yǎng)（可省略）

（3）梯度稀釋（4）涂布培養(yǎng)

（5）挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（6）微生物培養(yǎng)（純培養(yǎng)）（三）、實(shí)驗(yàn)流程第35頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三三、測定微生物的數(shù)量第36頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（一）測定微生物數(shù)量的方法1.直接計數(shù)法最常用：顯微鏡直接計數(shù)法（方法、優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)、適用條件）一、基礎(chǔ)知識第37頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三2、間接計數(shù)法：最常用的是稀釋平板計數(shù)法稀釋平板法稀釋涂布平板法稀釋混合平板法第38頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三（一）測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目配制ＥＭＢ培養(yǎng)基倒平板接種（濾膜法）培養(yǎng)觀察記錄二、實(shí)踐案例第39頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三1、土壤取樣（二）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)2、配制培養(yǎng)基尿素瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基第40頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三第41頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三3、樣品稀釋細(xì)菌：一般選用104

、105

、106倍的稀釋液進(jìn)行培養(yǎng)放線菌：一般選用103

、104

、105倍的稀釋液真菌：一般選用102

、103、104倍的稀釋液4、取樣及平板接種（涂布平板或混合平板）第42頁，講稿共45頁，2023年5月2日，星期三

在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變紅，就可以準(zhǔn)確的鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。5、培養(yǎng)與觀察：細(xì)菌：30～370C的溫度下培養(yǎng)1～2d；放線菌：25～280C的溫度下培養(yǎng)5～7d；霉菌：25～280C