植物遺傳轉化方法和技術

關于植物遺傳轉化方法和技術第1頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三

植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術、植物遺傳轉化技術及植物組織培養(yǎng)技術而發(fā)展起來的現(xiàn)代生物技術。通過植物基因工程獲得轉基因植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展及植物分子生物學研究中有十分重要的意義。目前，已獲得很多有重大經(jīng)濟價值的轉基因植物。第2頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構建目的基因與載體的拼接重組子導入受體分子外源基因的表達和產(chǎn)物的分離重組子的檢測第3頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三本節(jié)主要內容根癌農(nóng)桿菌介導法基因槍介導法其它轉化方法第一節(jié)植物遺傳轉化方法第5頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三常用的植物轉基因方法：到目前為止,已確立了11種植物轉基因方法。根據(jù)其轉化原理，可分為三大類，即利用載體的轉化系統(tǒng)，不用任何載體，采用物理、化學方法直接將外源基因導入受體細胞的直接轉化系統(tǒng)以及利用植物生殖細胞等種質媒介的種質轉化系統(tǒng)?，F(xiàn)將這三大類系統(tǒng)的載體、轉化原理、轉化方法和受體細胞等歸納如圖4-1。第6頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三一、根癌農(nóng)桿菌介導法根癌農(nóng)桿菌介導法的分子機制農(nóng)桿菌介導法需要具備的條件農(nóng)桿菌介導法的基本流程第8頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三1、植物冠癭瘤——植物的一種癌癥（1）冠癭瘤的起因：由根癌農(nóng)桿菌對植物的侵染而引起。（2）冠癭瘤的侵染過程：細菌通過傷口進入植物，在基因水平上轉化植物。細菌DNA中的編碼基因在植物細胞中表達，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌農(nóng)桿菌介導法的分子機制第9頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三2、Ti質粒根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質，為共價閉合環(huán)狀的DNA分子。第10頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；參與寄主細胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。

（1）Ti質粒的功能第11頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三（2）Ti質粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)

Vir區(qū)

Con區(qū)

Ori區(qū)200kb第12頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三①T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。第13頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三Vir區(qū)是一段長度為35KB操縱子；包含六個基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質粒DNA的三分之一。②Vir區(qū)操縱子基因的結構與功能LBRBT-DNAVir第14頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三③Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農(nóng)桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。④Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。第15頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三定向轉移到寄主植物細胞內T-DNA鏈整合植物基因組受傷植物產(chǎn)生酚類物質，誘導Vir基因的表達編碼核酸內切酶依次在RB、LB序列中產(chǎn)生缺口單鏈T-DNA被釋放3、T-DNA轉移的機制植物細胞酶體系合成雙鏈T-DNA鏈分子VirE2蛋白的核定位作用第16頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三4、植物遺傳轉化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢載體）雙元載體（反式載體）第17頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三①Ti質粒分子量過大，一般在160～240kb；②分布各種限制酶的多個切點；③T-DNA區(qū)內含有許多編碼基因，干擾宿主植物中內源激素的平衡，轉化細胞長成腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；④Ti質粒不能在大腸桿菌中復制,即使得到重組質粒，也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；⑤Ti質粒上還存在一些對于T-DNA轉移不起任何作用的基因。野生型Ti質粒不能直接作為植物基因工程載體：第18頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三5、農(nóng)桿菌介導的轉化質粒的構建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報告基因，選擇標記基因目的基因報告基因，選擇標記基因LBRB第19頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三啟動子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

第20頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三（二）農(nóng)桿菌介導法需要具備的條件高效的植物基因轉化受體系統(tǒng)受體植物細胞對農(nóng)桿菌要有很高的親和力。具有有效的選擇系統(tǒng)。穩(wěn)定的轉化技術和基因表達。第21頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三1、高效的植物基因轉化的受體系統(tǒng)成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。受體系統(tǒng)：用于轉化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。第22頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三A.植物基因轉化受體系統(tǒng)的條件（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來源（4）對選擇性抗生素敏感（5）對農(nóng)桿菌侵染有敏感性（6）具有經(jīng)濟價值或理論研究意義。第23頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三B.植物基因轉化受體系統(tǒng)的類型1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導形成愈傷組織，轉化（含目的基因質粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉化效率高。缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)第24頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三2.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點：材料局限，轉化率低。第25頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三3.原生質體再生系統(tǒng)原生質體恢復細胞壁具有分化再生能力，是應用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質，獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉基因植株嵌合體少，適用于多種轉化系統(tǒng)；缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。第26頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三4.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質的個體。優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質性好，接受外源基因能力強，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點：技術含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。第27頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三5.生殖細胞受體系統(tǒng)以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉化，如花粉管導入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。第28頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三2、選擇系統(tǒng)選擇是為了將轉化細胞與非轉化細胞區(qū)分開，使轉化細胞具有生長優(yōu)勢。在構建載體時，往往在目的基因上連上一個選擇標記基因。主要是編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的有：新霉素磷酸轉移酶基因(NPTⅡ)、新霉素抗性基因（neo）、慶大霉素抗性基因（gent）、潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）,以及膦絲菌素乙酰轉移酶基因（bar）等。第29頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉座子Tn5中分離的，其對應失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418。對茄科植物（煙草、馬鈴薯、番茄）轉化特別有效，對豆科和單子葉植物效果不佳。A、新霉素磷酸轉移酶基因（Npt-II）第30頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三B、慶大霉素抗性基因（gent）該基因編碼一種乙酰轉移酶，屬抗生素標記基因，它通過對慶大霉素的乙?；蛊涫Щ睢Ｔ撨x擇系統(tǒng)目前也有一定的應用，例如矮牛、煙草和番茄。第31頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三

潮霉素是一種很強的細胞抑制劑，對許多植物都有很強的毒性。潮霉素磷酸轉移酶可通過對潮霉素磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）第32頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三D、膦絲菌素乙酰轉移酶基因（bar）該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對應的選擇試劑為膦絲菌素（basta），膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導致非轉化細胞發(fā)生氨的致死性累積。第33頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三（三）農(nóng)桿菌介導法的基本流程第34頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三大豆子葉節(jié)法為例：大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化大豆農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)的優(yōu)化第35頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三大豆無菌苗的獲得外植體的制備（類型、生理狀態(tài)）高分化率基因型的選擇叢生芽誘導培養(yǎng)基的確定叢生芽伸長培養(yǎng)基的確定生根培養(yǎng)基的確定移栽大豆子葉節(jié)器官發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化第36頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三選擇壓的確定農(nóng)桿菌侵染液的制備外植體苗齡預培養(yǎng)（時間）農(nóng)桿菌的侵染（濃度、時間）共培養(yǎng)（時間）選擇培養(yǎng)抗性芽的伸長生根培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)的優(yōu)化第38頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體棉花第39頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三(a)Embryogeniccalligeneratedfromthescutellaofmatureseeds.ArrowheadsshowactivelygrowingcalliappropriateforAgrobacteriuminoculation.(b)InoculationofcalliwithA.tumefaciens.(c)Proliferationofhygromycin-resistantcallionN6D-Smedium3weeksaftertransfer.Leftcalliareresistanttohygromycinandrightcalliaresensitive.(d)ShootregenerationfromcalliresistanttohygromycinonMS-NKmedium3weeksaftertransfer.(e)Rootingandgrowthoftransgenicriceplants.第40頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三二、基因槍法（微彈轟擊法）1、工作原理：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細胞或組織，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上并得到表達，從而實現(xiàn)外源基因的轉化。第41頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質體，具有相當廣泛的應用范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉基因植株。第42頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三2、操作步驟：（1）制備DNA微彈；（2）準備靶外植體材料；（3）DNA微彈轟擊；（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．immatureembryoshighosmoticmediapreparecalli第43頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第44頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三3、轉化率影響因素：金屬微粒：金粉顆粒較鎢粒性質優(yōu)良,但是價格昂貴.DNA沉淀輔助劑：這些化合物對DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對植物受體細胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內在因素第46頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三基因槍法的優(yōu)點：無宿主限制；靶受體類型廣泛；可控度高；操作簡便。問題：轉化效率低；嵌合體多；穩(wěn)定性差，瞬時表達；外源基因沉默；整合機理不詳。4、基因槍轉化法的特點：第47頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三花粉管通道法在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。第48頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三第49頁，講稿共57頁，2023年5月2日，星期三花粉粒的內壁通過花粉外壁上的萌發(fā)孔（或溝）向外伸出的細管。一般每個花粉粒萌發(fā)時產(chǎn)生一個花粉管，具多萌發(fā)孔的花粉粒開始