第二章 第一節(jié)基因操作的工具酶

基因工程張銳第二章基因操作原理第一節(jié)分子克隆的工具酶第二節(jié)載體第三節(jié)電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)第四節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第五節(jié)基因克隆的策略第六節(jié)生物芯片第七節(jié)基因文庫的構(gòu)建第八節(jié)分子標(biāo)記技術(shù)第一節(jié)基因操作的工具酶一限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二DNA連接酶及其應(yīng)用三DNA聚合酶及其應(yīng)用四修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類和命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用50年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象(K)(B)大腸桿菌B大腸桿菌K1110—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)E.coliC100%限制—修飾的酶學(xué)假說(B)(B)酶切位點不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點被修飾Methylation基因組DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。KKBB限制性核酸內(nèi)切酶的概念

限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點1000bp不是無用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點3‘端24-26bp處是有用限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母（大寫）和種名的頭兩個字母（小寫）組成3個斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichiacoli

表示為Eco,流感嗜血菌Hemophilusinfluenzae

表示為Hin；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如EcoRI、HindIII。E資Es管ch克er倦ic橡hi林a(屬)co徒co河li(種)R簡RY針13校(品系)I首先浩發(fā)現(xiàn)栽在此沙類細憶菌中占發(fā)現(xiàn)造的順謊序3.傲I六I型限森制性弄核酸敢內(nèi)切捧酶的3大特致點1、識摔別位蝕點的惑特異駱性每種宏酶都刪有其臭特定傳的DN障A識別位點汽，通離常是板由4、5、6或7個核繪苷酸匠組成熄的特吃定序列（臉靶序只列）允。2、識償別序懸列的糧對稱醋性靶序移列通騰常具析有雙傍重旋彼轉(zhuǎn)對難稱的結(jié)萍構(gòu)，炮即雙講鏈的烘核苷冒酸順資序呈叼回文扶結(jié)構(gòu)慕。3、切言割位吼點的元規(guī)范敗性雙鏈DN反A被酶在切后時，分勻布在敬兩條鏈賞上的緒切割橫位點兔旋轉(zhuǎn)忽對稱懶（可閃形成中粘性報末端吳或平末端蠢的DN淚A分子技）。與II型核戚酸內(nèi)祖切酶倦有關(guān)壯的幾安個概此念粘性晉末端co喂he泉si委veen杜ds因酶速切位熔點在嚴(yán)兩條DN游A單鏈泊上不蹤蝶同（鄭對稱鄰）酶切后終形成含的具砌有互灶補堿銅基的廣單鏈賀末端袍結(jié)構(gòu)弱，酶業(yè)切產(chǎn)樓生的獎兩個紡粘性丈末端很容易通過陰互補刮堿基久的配砍對而捷重新連接起來孟。平灣末午端Bl屯un蠢t蒼en咱d因酶進切位灣點在扇兩條DN發(fā)A單鏈再上相稼同，藥酶切煮后形頌成的殖平齊的末詳端結(jié)約構(gòu)，峰這種洪末端不易重新連接起來當(dāng)。同位著酶識別便相同獅序列槍的酶飯稱為釋同位劫酶。同裂岸酶is坊os軍ch申iz謎om寶er碗s能識查別和冊切割潑同樣嬸的核從苷酸悶靶序奪列的碌不同世內(nèi)切予酶。臟（切驢割位子點不尼同）強（同截序同洽切酶趕、同緊序異桑切酶目）同尾看酶is叼oc柜au謹(jǐn)da腰me歉rs識別拒的靶怒序列焦不同妨，但香能產(chǎn)嶄生相竄同粘湊性末扇端的鍵一類限樂制性行核酸協(xié)內(nèi)切桃酶。注疤意：由同周尾酶窗產(chǎn)生綱的粘終性末計端序貨列很壟容易召重新閑連接述，但鹽是兩袋種同貪尾酶消化壘產(chǎn)生盈的粘搏性末垂端重掙新連吉接形防成的鎮(zhèn)新片返段將談不能快被該仇兩種傷酶的任一誤種所退識別濾。幾種II型限炒制性編核酸竊內(nèi)切泄酶的緞酶切瓣位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

經(jīng)同關(guān)尾酶揚消化遮的DN隊A末端緞連接童示意占圖5’使X袍XX齡XG走G兆AT晝CCXX歇XX窩XX格3伴’3’齡X阿XX冊XCC死TA私G欠GXX全XX博XX貼5經(jīng)’Ba峽mH斜I5’坡X們XX歪XG泳GA蔽TC款CXX賊XX累XX偽3兩’3’扣X塘XX魄XCC肺TA喘G芒GXX跨XX典XX蔑5忌’5’滑X抓XX如XA歪G智AT提CTXX亭XX蟲XX康3宇’3’罩X灑XX用XTC劫TA治G尤AXX濫XX蔽XX疊5孩’Bg祥lII5’繁X胳XX次XAGA塌TC童TXX溪XX漁XX智3瞎’3’蚊X部XX慮XTC道TA勾GAXX偉XX貫XX報5杜’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII推測普酶切胳割位擠點出啞現(xiàn)的燭頻率墾對于千推斷DN蒙A酶切野片段叢大小險很有掙用。假定4種核映苷酸驕在DN素A分子遲上出甚現(xiàn)的街頻率揚相同需，那庫么靶裙序列轟為6個核擦苷酸諷的內(nèi)岔切酶震在每46（=4溝09扁6）個核穩(wěn)苷酸榮中酶創(chuàng)切位比點就舍有一鑼次出爺現(xiàn)機假會。女據(jù)此著推算秘，一財條49臨00落0b繁p長的DN壓A中有12個6核苷僻酸識污別序少列的捏酶切離位點枕（49覽00敘0/抹40物96）。蓄但事吃實上完并非持真正氣如此墻，因賺為DN因A分子偽中4種堿粗基的糖出現(xiàn)煩頻率心并不叔均等萌。識別祖位點滲在DN囑A分子熟上出森現(xiàn)的克頻率一個壞酶活凈單位（U）指：在理圍想的帝反應(yīng)啊條件霞（適腹宜的叉緩沖配液和田反應(yīng)驕溫度丟，通精常為37凝℃）下畢，50L反應(yīng)羽體系專中完蒙全降疫解1康g冬鞏D秋NA所需曠要的合酶量哪。影響詞酶活啄性的買因素傭很多籠，最蠶重要并的有遇：A。DN吃A的純頌度和覆甲基誤化程踩度B。甘油戲的含漂量（鬧不超搬過5%）C。反應(yīng)圾體系殘中的休離子吳強度D。反應(yīng)壩體系慕的pH值F。反應(yīng)鑒的溫葡度條睛件（通帥常為37遲℃）酶單荒位的嘴定義棚和影瞞響酶匯活性攀的因畏素Bu監(jiān)ff都er質(zhì)(單10X)災(zāi)2.持0LWa尿te阻r個1牢6.潮5LDN尤A襪1耽.0LEn文zy生me蕉0.眠5LVo補lu沉me恒20覽.0L4、限吐制性碰核酸疫內(nèi)切限酶的拿消化擠反應(yīng)酶散切伐反匯應(yīng)訊的斑基尋本羊步就驟＋－電泳紫外苦分析37悅℃劇1h加反帳應(yīng)液CKMBu脫ff聯(lián)er鑒(鉆10X)紀(jì)2.監(jiān)0LWa飛te腸r筒1遇6.價5LDN掃A俗1.碰0L（1g/L）En味zy惱m(xù)e潮0.嚷5LVo羅lu杜me穿20手.0L1.江0k弄b1.望0k兆b0.岸4k慮b0.糾5k利b0.箏6k膝bCKMTT限制蓋性核陵酸內(nèi)環(huán)切酶挑的應(yīng)捐用用于線轉(zhuǎn)基墊因后北轉(zhuǎn)化顧子的陪鑒定用于吼分子摘標(biāo)記羨（RF逆LP）分甲析遺疾傳多共樣性用于則構(gòu)建美基因取庫（Ge杏no禾me黃w矩al勢ke叉r）1、DN蒼A連接答酶作忌用的綢特點2、DN塌A連接田酶的冰反應(yīng)閣條件3、DN肅A連接怪的策碎略二DN淚A連接而酶及裕其應(yīng)竊用DN束A連接隨酶的劫發(fā)現(xiàn)環(huán)形DN慕A分子睬的發(fā)缸現(xiàn)使夜科學(xué)那家相跪信一叨定有押一種仙能連作接這哲種Ni向ck的酶絹存在仆。19塑67年，惠世界泡上幾暗個實鏟驗室博幾乎勺同時濱發(fā)現(xiàn)態(tài)了一垂種能漁夠催肢化在2條DN旋A鏈之棋間形喘成磷酸秘二酯昨鍵的酶——DN針A連接端酶（li傾ga鑰se）。DN虜A連接寫酶由大嘴腸桿催菌基才因組DN澆A編碼折，以NA如D+作為重能源號輔助始因子；T4床DN氧A連接保酶由大墓腸桿六菌T4噬菌濾體DN信A編碼摧，以AT芽P作為澆能源笛輔助寇因子鋒。（19套70年）騾容緣瑞易制大備，溜而且疏可以遵連接呀完全廳配對撓的平庭末端DN膽A分子烤，所以在倆基因在克隆處中應(yīng)孝用廣擦泛。NickNick1、DN穴A連接固酶作快用的害特點DN去A連接環(huán)酶作稈用的躲特點A.連接謎的兩亡條鏈駱必須雪分別甩具有3′端自危由羥擺基（-O勾H）和5母′端磷竟酸基構(gòu)團（-P），和而且緩只有予這兩滑個基店團彼此相杯鄰時術(shù)才能魂進行貨連接堵反應(yīng)賀；B.在羥律基和曲磷酸耽基團捕間形敵成磷越酸二峽酯鍵甘是一賣種耗寶能過程，事因此燥連接債反應(yīng)養(yǎng)必須塌有能六量分欄子的柴參與夾，通器常有兩種庭能量半分子刻，即AT范P和NA言D+。OKNO連接酬酶的母酶活歐單位曬（U）：旨以T4把D摟NA連接泳酶命珠名，隱在最門佳的布緩沖買體系繼及15藥℃、1h之內(nèi)詠，在10趁~1隸5μ餓L反應(yīng)散體系街中完撥全連圓接1μ潑g悼λD來NA的Hi版nd落Ⅲ片段果所需朋的酶磚量，從稱為1U。載體柳去磷晶防止渴自連何的應(yīng)冤用示和例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接澇酶連接怨酶連接予酶堿性燭磷酸泳酶2P嚼i寄主鐵修復(fù)哨缺口載體縱自連攔或產(chǎn)德生二股具體恢等2.念DN賽A連接私反應(yīng)嘆的條特件連接衛(wèi)反應(yīng)溜最佳養(yǎng)溫度銜為37革℃，但紫是此嶼時粘橫性末獨端間片氫鍵窮結(jié)合尼不夠念穩(wěn)定姑，而貨且酶為活性眨也會憑迅速仔降低誰。比悠如，Ec義oR堆I粘性摩末端佩連接落部位掠只有4個堿卻基對碼，很歪容易困斷開溪。所遺以通常桑在4-宮15黎℃連接爹。影響德連接郵效率福的因侍素有謹(jǐn)：A.溫度療（最規(guī)主要莊的因益素）B.淘A乳TP的濃鄭度(擾1M舅-論1犁0稍M)C.連接裙酶濃彈度（擾平末滿端較撒粘性脅末端倆要求正高）D.反應(yīng)蹄時間攤（通如常連搏接過仇夜）E.插入側(cè)片段蟻和載窩體片摘段的摩何爾比轉(zhuǎn)化4℃過夜加反應(yīng)液CK-重組菌落CK+粘性列末端DN往A片段新的連市接NickNick3、DN折A連接婆的策殲略平末供端DN游A片段的的末史端加偽尾連澤接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’AAAAA3’3’5’5’TTTTDN遷A聚合編酶和T4俯DN傭A連接神酶平末史端DN竄A片段訴加接券頭連瞞接法銜接資物(l造in繭ke販r)，也寒叫接炭頭，是由境人工射化學(xué)丙合成傾的一駱段10守-1各2個核濕苷酸魚的DN賀A雙鏈泰，其夸中包她含有1個或濁幾個暢限制椅性酶負切位箏點。嘆使用簽時只冠須將瘋銜接葡物和勞目的守片段冤的5′端用蕩多核芒苷酸娛激酶雖處理串使之浪磷酸演化，偏然后涌用T4闊DN艦A連接顏酶進鳥行連罰接，孝就可榆獲得澆能產(chǎn)鴨生粘撿性末蘿端的DN借A片段稅。CC預(yù)GA壇AT濤TC祖GGGG貴CT馬TA桑AG橫CC磷酸飾化CC稈GA獎AT寶TC拌GGGG胸CT汪TA訂AG門CCPOHOHPPPOHOHT4連接槐酶CC址GA幼AT末TC保GGGG鈔CT欣TA蓋AG群CCPOHPOHEc符oR鉆ICC五GA爪AT縮慧TC閥GGGG老CT磨TA細AG展CCAA蛇TT循CG補GGC廊CCC卸GGG嘗CT徐TA賞A當(dāng)不區(qū)同的封酶產(chǎn)徹生的酸黏性濁末端矛不能逢互補廢配對梯時如笛何連設(shè)接？連接飼酶的表應(yīng)用DN女A的重野組加接犯合適勺的接殖頭第一喪節(jié)記基歲因操求作的期工具歐酶一沒限孝制性椒核酸碌內(nèi)切這酶及現(xiàn)其應(yīng)森用二DN騰A連接腰酶及圖其應(yīng)購用三DN敏A聚合雨酶及但其應(yīng)峽用四饅修爽飾性污工具店酶Ge興ne打ti定c仗en土gi拾ne悟er幼in慰g笨is外l埋ar潤ge榜ly拋a鑄n竿ex碰er遞ci喬se增i贈n建ca市re攜fu律ll礎(chǔ)y必co貪nt遲ro勿ll恨ed筍e射nz浙ym援ol疏og夸y.膜A私v逆ar床ie煎ty長o吐f糞en拌zy植me詠s醫(yī)fo慌rm把t圖he雹b約as找ic閱t表oo李lk侮it肆o陡f癢th剝e被ge壘ne暴ti日c谷en拼gi踩ne岸er熔.1、大馬腸桿董菌DN駐A聚合躍酶I2、Kl高en理ow片段3、T4霉D跌NA聚合卵酶4、逆慨轉(zhuǎn)錄垂酶（幻玉反轉(zhuǎn)柱錄酶柄）三DN靠A聚合乞酶及耀其應(yīng)裳用大腸晚桿菌DN也A聚合蹦酶I（E。Co光liDN咽A乏po炮l社I）是Ko儀rn悔be躁rg頌A蠻.口19消56年首向先從嶄大腸年桿菌E。Co剖li細胞躲中分晝離出騙來的翅。它適是一逝種多糧功能續(xù)性的漆酶，潤包括3種不焦同的皮酶活迅力：5′子-賞3′聚合未酶活旺性以雙核鏈DN稅A為模探板，雷催化銷單核貿(mào)苷酸撇結(jié)合按到引兵物的3′屯-O第H末端爹，并挎不斷念延伸獄。5′條-坑3′外切動酶活演性將雙程鏈DN聯(lián)A中游筑離的5′末端中逐個治切去賓。3′牧-壓5射′外切較酶活灣性將游蜓離的臺雙鏈襪或單茅鏈DN棋A的3′端降閣解?；蟛贿^彈對于翻雙鏈申的降崗解可耍被5′買-3喝′的多籮聚活瞞性所吐抑制秋。CC訴GGG餃CT憂AT幸CG沸GACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCC痕TCC春GA蘋TA竊GC墻CTGG麗CT蜂AT跨CG輩GACC關(guān)GA庫TA奶GC牢CTGG君CT深A(yù)CCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T大腸幫桿菌DN校A聚合暖酶I的三雀種用洗途A.制備型高比齒活度衣的DN顫A探針利用揮其5′寄3慈′的外勿切酶標(biāo)活性厲及其療聚合燃酶活黃性。B.用于DN陵A連接黑后的敢大缺刃口填餡充利用5′撤3抓′的聚巷合酶爐活性誰。C.用于DN產(chǎn)A的序半列分單析利用5′陣3′的聚友合酶可活性揚。大腸來桿菌疾聚合印酶I的應(yīng)掏用示遲例CC齡GA盜TA敵GC紅CTGG綢CT辭AT季CG豆GACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+切口拌平移(N笛ic悄k濤tr萬an知sl亞at稠io善n)CC折GGG閘CT豎AT贊CG黃GACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCC溫T1、大痰腸桿唇菌DN咽A聚合餡酶I2、Kl島en轟ow片段3、T4科D傘NA聚合諸酶4、逆芬轉(zhuǎn)錄窩酶（仔反轉(zhuǎn)甩錄酶螺）三DN熄A聚合惰酶及據(jù)其應(yīng)獄用Kl峽en載ow片段條的主傍要用魚途Kl超en少ow片段大腸咐桿菌羊聚合舅酶I全酶尸經(jīng)枯草蠶桿菌蟻蛋白步酶處理慨后產(chǎn)狐生的哨大片菊段酶箏分子滑，它鳴仍然禽有5′連3僅′的聚剃合酶瓣活性辯和3′5摟′的核簡酸外想切酶禁活性汗，但圍失去房誠了5′繞3′的外修切酶喚活性刃。Kl員en糧ow片段的主以要用熔途修補險限制喚性酶續(xù)消化DN揀A形成宋的3′隱蔽最末端標(biāo)記DN愧A片段遇的末植端cD恰NA克隆妙中第侮二鏈cD械NA的合稿成DN雄A序列涌的測尿定GAACT車TA垮A1、大老腸桿骨菌DN指A聚合亦酶I2、Kl康en亂ow片段3、T4、T7貪D鞏NA聚合喉酶4、逆滑轉(zhuǎn)錄求酶（畜反轉(zhuǎn)穴錄酶研）三DN謹(jǐn)A聚合媽酶及材其應(yīng)腫用T4、T7約DN跳A聚合甘酶的符特點T4粉D撲NA聚合板酶是從T4噬菌芝體感胞染了腿的大共腸桿歉菌中摸分離西出來要的，糧它和大腸際桿菌遼聚合咐酶I一樣具有5′棵3妄′的聚尸合酶恭活性迷、5′貌3開′的外掩切酶矛活性津和3栗′泉5屈′的核棉酸外紙切酶法活性豬。其外慈切酶幣活性刺要比政大腸跨桿菌洋聚合戀酶I的活汽性高20達0倍。T7士D屢NA聚合宏酶是從T7噬菌篩體感差染了戴的大豎腸桿愈菌中娛分離忍出來晨的，T7叼D圍NA聚合糕酶是滿所有DN債A聚合似酶中醫(yī)持蛾續(xù)合傍成能鼻力最怪強的割一種捧酶，其3鳳′錯5跳′的核滔酸外距切酶盞活性隊是Kl以en猾ow宗D廟NA聚合驕酶的10順00倍。T7削D執(zhí)NA聚合合酶可喚以替拾代T4催D撓NA聚合莫酶的趴功能薪并能擦用于皺大片看斷的掩擴增雞。T4煌D終NA聚合鹽酶的犧用途1、以先填充雖反應(yīng)桶標(biāo)記輩有5′端延鳴伸的撲雙鏈DN先A片段亞；2、以僚取代鵲反應(yīng)簽標(biāo)記利延伸穩(wěn)末端賺或平蒼頭末睡端的雙橋鏈DN映A片段羽；3、用蘭于DN腫A序列廈分析館；耐熱耍的DN滲A聚合鑄酶耐熱桑的DN菊A聚合漫酶是主在高翅溫下怒具有討活性魔的DN清A聚合多酶，曾來自投嗜高臂溫的寇細菌皺主要爺用于PC糕R反應(yīng)兇，如Ta訴q爸DN卵A聚合臟酶、Pf籮u耐DN革A聚合東酶等喪。1、大萌腸桿認(rèn)菌DN集A聚合憶酶I2、Kl呼en嬸ow片段3、T4量D羊NA聚合犬酶4、逆撞轉(zhuǎn)錄獅酶（致反轉(zhuǎn)秀錄酶氧）三DN襯A聚合志酶及焰其應(yīng)材用逆轉(zhuǎn)痰錄酶—R亂ev惰er陡se揪t暗ra介ns守cr咸ip鎖ta毯se逆轉(zhuǎn)吃錄酶避是一種?？梢詰儆行~地將mR渾NA轉(zhuǎn)錄猶成為DN堵A的酶脈，其欣產(chǎn)物敗稱為cD困NA掠(家co廣mp燈le萌me京nt兵ar竟y洗DN椅A)事.實際歡上，蒜它也之是一額種RN面A依賴替的DN術(shù)A聚合濟酶。逆轉(zhuǎn)臉錄酶壘首先石是19爸70年從燦鼠白瓣血病忙毒和寶勞氏六肉瘤僚病毒頌中發(fā)霉現(xiàn)的祥。這兩全個課顆題組酬的論估文都評發(fā)在持了同廟一期駕的《N菜at賣ur煤e》雜志怎上。主要杜用途啟是將mR據(jù)NA轉(zhuǎn)錄盛成cD抱NA以制宿備基行因片廊段。3’虜A而AA副AA專AA您AAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第一霞節(jié)庸基遷因操碧作的立工具抱酶一鬧限重制性傲核酸趙內(nèi)切搞酶及摘其應(yīng)咬用二DN折A連接助酶及杰其應(yīng)覽用三DN吵A聚合鳳酶及杰其應(yīng)熄用四貧修忌飾性填工具古酶Ge灶ne才ti照c甲en紀(jì)gi屠ne智er疤in勢g羅is鳥l閱ar哀ge假ly要a逼n獨ex株er圈ci堪se墨i僚n融ca敞re居fu盡ll卡y簽co逆nt貌ro貨ll津ed慎e軌nz山y(tǒng)m惑ol朱og涌y.產(chǎn)A扁v反ar既ie暖ty舅o件f免en嚴(yán)zy趟me稅s穩(wěn)fo痛rm勒t犧he兄b估as昌ic巨t史oo涌lk及it排o蠟f覆th京e瞧ge絡(luò)ne粘ti爬c移en屑gi高ne攝er淺.1、末掃端轉(zhuǎn)鳳移酶列（te蔑rm央in企al滾t則ra要ns耍fe犁ra閃se）2、核梳酸酶SI（SI膜n運uc信le殺as姨e）4、堿系性磷罩酸化照酶四鳳修尸飾性瓦工具椒酶末端咱轉(zhuǎn)移基酶的奧特性末端歌轉(zhuǎn)移盆酶是慚一類聲不依佩賴于DN錘A模板撇的DN嘗A聚合增酶。該類載酶可規(guī)以在劣沒有根模板驚鏈存蠻在的姥情況閱下，斧將核較苷酸嬌連接卻到DN丸A的在3‘羥基驕，特錯別是織對于憂平末常端的獅雙鏈DN佳A末端尊加尾漂十分卵有效澡。最常挨見的窗用途雨是在采酶切勢產(chǎn)生獎的平何末端細加尾常以便營于創(chuàng)避造粘狂性的糕互補靠末端。平末哄端DN階A片段環(huán)的末舊端加頃尾連浩接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶1、末條端轉(zhuǎn)參移酶召（te抹rm下in序al陣t攜ra宣ns躬fe妨ra材se）2、核堤酸酶SI（SI櫻n舟uc楊le胃as庫e）3、堿資性磷拍酸化敞酶（Al沃ka綢li諷ne幼p何ho測sp撕ha彎ta氣se）四犯修架飾性圣工具么酶核酸柿酶SI的特倉性這是免一種詳從米曠曲霉湖（As紅pe掃rg追il梢lu爬s漫or喇yz巨ae）中嘩分離首的可娃以降紛解單傭鏈DN極A或RN乓A的外假切酶。其主余要用接途有（降鎖解單刃鏈核棗酸）A、在cD蔥NA合成廢過程夾中，紋切開cD婚NA的發(fā)腰夾末的端；B、載傻體構(gòu)贏建過盾程中斗，切現(xiàn)去DN聞A片段藏的單書鏈尾殿巴，形成滋平末書端結(jié)驅(qū)構(gòu)。3’卻A廁AA爺AA康A(chǔ)A丈AAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

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