Cell新技術(shù)突破韓碩等報道RNA測序新方法-檢測亞細胞水平轉(zhuǎn)錄組空間分布

Cell新技術(shù)突破韓碩等報道RNA測序新方法——檢測亞細胞水平轉(zhuǎn)錄組空間分布明確細胞中不同RNA的空間分布特征對于理解RNA的細胞功能及調(diào)控具有重要作用。特定RNA分子的非對稱、不均勻分布與維持染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，蛋白區(qū)域化翻譯（localtranslation），組織發(fā)育等多種生命過程具有密切關(guān)系，所以在轉(zhuǎn)錄組層面系統(tǒng)研究分析RNA空間分布具有重要生物學意義【1】。目前常用的手段包括經(jīng)典的生化離心分層來獲取各種細胞器，隨后進行RNA測序（fractionation-seq）。但這種方法不僅容易引入很多雜質(zhì)分子，而且僅限于可以被純化的細胞器，很多重要細胞區(qū)域（比如核纖層、核孔、線粒體外膜等）都無法被有效提取。近年來發(fā)展的新型RNA熒光原位雜交成像技術(shù)，例如哈佛大學莊小威實驗室發(fā)明的merFISH【2】，可以同時獲取單細胞中上千種RNA的空間信息，但這種基于探針雜交的手段無法像測序那樣獲取RNA全部序列信息，并且這類技術(shù)需要的復雜的自動化設(shè)備也無法普適于大多數(shù)實驗室。因此，目前亟需一種在轉(zhuǎn)錄組層面，能對活細胞中各種類型RNA準確定位、具有高時空分辨率的測序方法。2019年6月20日，來自斯坦福大學的化學生物學家AliceTing教授和RNA生物學家HowardChang教授及其團隊在Cell雜志上合作發(fā)表了題為AtlasofsubcellularRNAlocalizationrevealedbyAPEX-Seq

的文章，Ting實驗室的博士生韓碩與Chang實驗室的博士后FurqanFazal為論文的共同第一作者。該工作發(fā)展了一種名為APEX-Seq的RNA測序技術(shù)，通過基因編碼的過氧化氫酶APEX2在H2O2催化1分鐘后，直接在活細胞內(nèi)對指定區(qū)域（利用特異性融合蛋白或定位信號將APEX定位在目標區(qū)域）的RNA進行高精度的生物素標記，然后利用鏈親和素修飾的磁珠對標記的RNA進行富集后進行深度測序（圖1）。基于這一方法，作者對包括細胞核、核孔、核纖層、核仁、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜、線粒體基質(zhì)，線粒體外膜在內(nèi)的9個亞細胞區(qū)域/結(jié)構(gòu)的RNA組成進行了全面的分析，繪制了HEK293細胞內(nèi)以這9個位置為坐標的轉(zhuǎn)錄組空間分布圖譜，以及細胞在不同刺激下部分區(qū)域RNA分布的動態(tài)變化。圖1.APEX-Seq技術(shù)的簡單流程示意圖APEX（engineeredascorbateperoxidase）生物素標記是AliceTing實驗室發(fā)展的“鄰位標記”（proximitylabeling）系列技術(shù)中一種重要的活細胞標記手段【3】。用于蛋白組學的鄰位標記在短短幾年之內(nèi)已成為研究細胞生物學和生物化學不可替代的重要方法，在解決亞細胞層面細胞器蛋白組成、蛋白-蛋白相互作用等基礎(chǔ)問題上發(fā)揮著越來越核心的作用【4】。因此作者設(shè)想是否可以把這種技術(shù)從蛋白質(zhì)拓展到RNA層面。為此作者首先進行了細胞外以及活細胞內(nèi)的APEX標記實驗，通過dot-blot確認了APEX催化生物素酚類自由基可以直接與RNA發(fā)生化學反應(yīng)，實現(xiàn)RNA的共價生物素標記。為了測試新建立的APEX-Seq方法，作者先將APEX定位到一些已知RNA組成的細胞區(qū)域，包括線粒體基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜（ERM），通過鄰位標記測序成功富集了線粒體內(nèi)相應(yīng)的RNA，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上編碼外分泌蛋白的RNA，表明APEX-seq在封閉和開放細胞區(qū)域都具有極高的特異性和空間分辨率。驗證了APEX-Seq方法之后，接著將該方法推廣到了上述9個細胞結(jié)構(gòu)/區(qū)域，繪制了轉(zhuǎn)錄組的亞細胞空間分布圖（圖2，注：由于線粒體基質(zhì)區(qū)域內(nèi)只有13個線粒體DNA編碼的mRNA與2個rRNA，在數(shù)據(jù)分析中并沒有包括這一區(qū)域，所以左圖只有8列）。這個龐大的數(shù)據(jù)庫既驗證了許多過去對單個RNA研究總結(jié)得出的結(jié)論（比如大部分lncRNA都主要分布于細胞核中），又包含了很多以前未知的RNA空間信息。對于新的發(fā)現(xiàn)，作者通過離心分層測序和熒光成像兩種經(jīng)典的方法進行了交叉印證。圖2.通過9個亞細胞區(qū)域APEX-seq得到的RNA空間分布圖譜為了進一步證明APEX-Seq數(shù)據(jù)可用以提出和檢驗新的生物學猜想，文章先后簡單分析了同一RNA不同亞型（isoform）的差異分布，內(nèi)含子滯留核內(nèi)，m6A修飾與出核運輸關(guān)系，以及細胞核內(nèi)特殊RNA結(jié)構(gòu)域分布等一系列問題，發(fā)現(xiàn)了很多有趣的RNA空間調(diào)控的規(guī)律。例如，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的SINE和LINE序列在細胞核內(nèi)的核纖層區(qū)域有最高的富集等等。最后，為了展示APEX-Seq極高的時間分辨率（1分鐘標記）可用于研究RNA動態(tài)變化（圖3），作者用4種不同小分子對活細胞進行了短暫干預(yù)（包括2種不同機理的蛋白翻譯抑制劑，1種線粒體膜電位抑制劑和1種微管形成抑制劑），詳細研究了參與線粒體外膜周圍RNA定位的相關(guān)過程，以及微管抑制過程中RNA分布的變化過程。圖3.APEX-seq可以得到RNA在不同空間和時間的動態(tài)分布總之，該文章發(fā)明了一種亞細胞層次轉(zhuǎn)錄組空間分布的RNA測序新方法APEX-Seq，具有極高的時間和空間分辨率，深度挖掘其產(chǎn)生的RNA分布圖譜也可作為提出新的生物學猜想的源泉。原文鏈接：/10.1016/j.cell.2019.05.027

制版人：珂參考文獻1.Buxbaum,A.R.,Haimovich,G.,andSinger,R.H.(2015).Intherightplaceattherighttime:visualizingandunderstandingmRNAlocalization.NatRevMolCellBiol

16,95-109.2.Chen,K.H.,Boettiger,A.N.,Moffitt,J.R.,Wang,S.,andZhuang,X.(2015b).Spatiallyresolved,highlymultiplexedRNAprofilinginsinglecells.Science

348,aaa6090-aaa6090.3.Lam,S.S.,Martell,J.D.,Kamer,K.J.,Deerinck,T.J.,Ellisman,M.H.,Mootha,V.K.,andTing,A.Y.(2014).DirectedevolutionofAPEX2forelectronmicroscopyandproximitylabeling.NatMethods

12,51-54.4.Rhee,H.W.,Zou,P.,Udeshi,N.D.,Martell,J.D.,Mootha,V.K.,Car