液相色譜儀使用方法

關(guān)于液相色譜儀使用方法第1頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三一、什么是色譜色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器。色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測手段，就成為色譜分析法。常見的分離方法：蒸餾、離心、電泳、過濾、超濾、等等。色譜法的發(fā)明人：俄國科學(xué)家：麥克海爾.塞蒙諾維奇.維茨特

M.S.Tswett第2頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三二、什么是液相色譜呢液相色譜：流動相是液相液相色譜柱色譜紙色譜HPLC薄層色譜第3頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三三、什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段。具有高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器。第4頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三HPLC的分離原理、儀器配制和工作流程分離原理動畫演示溶劑

色譜泵進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)請單擊請單擊請單擊請單擊請單擊第5頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三四、高效液相色譜法的特點(diǎn)“三高一廣一快”：①高壓：對載液加高,流動相能迅速通過色譜柱壓.②高效：分離效能高。③高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級。④應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析。⑤分析速度快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15—30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。第6頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三五、高效液相色譜法的主要類型及原理1、液-液分配色譜2、液-固吸附色譜3、離子交換色譜4、離子對色譜5、離子色譜6、排阻色譜7、親和色譜(AC)第7頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三1、液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C18柱（反相柱）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。第8頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三反相高效液相色譜法即指流動相的極性大于固定相極性的色譜方法。在本法中常采用化學(xué)鍵合相作為固定相，流動相采用水—甲醇或水—乙腈系統(tǒng)，在反相色譜中，極性強(qiáng)的組分在分離時先流出柱子，極性弱的組分后流出。因此適合于共存組分極性差異較大的樣品分析。第9頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三乙腈(jīng)乙腈又名甲基氰，分子式CH3CN，無色透明液體，密度小于水，約為0.79，能與水和乙醇等有機(jī)溶劑以任意比混溶，易燃，有毒性。第10頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三2、液-固吸附色譜基本原理：各組分在固定相吸附劑上競爭性吸附與解吸固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。特點(diǎn)：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附，常引起峰的拖尾第11頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三六、色譜柱液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10μm的范圍內(nèi).另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN,-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的(C18)非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10μm之間。第12頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三1.色譜柱的選擇第13頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三2.本公司使用的柱子主要特點(diǎn):使用過程中柱壓穩(wěn)定，即使長時間使用也不會出現(xiàn)拖尾等異常情況使用壽命長，清洗頻度低，僅為同類產(chǎn)品的15%第14頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三七、樣品的前處理a、最好使用流動相溶解樣品。b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。d、利用超聲儀脫氣。第15頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三八、流動相的配制a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中

。b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；同時降低柱壓，延長液體泵的使用壽命d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。e、流動相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡。f、在流動相配制好后，使用0.45μm濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣。第16頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三九、流動相流速的選擇因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。當(dāng)選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。第17頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三十、檢測過程的操作樣品檢測前控制平臺的準(zhǔn)備工作樣品檢測時的操作請單擊請單擊請單擊第18頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三十一、HPLC常用操作步驟1)首先對流動相進(jìn)行過濾，常用的孔徑為0.22um和0.45um。2)對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3)正常情況下，先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進(jìn)入測試用流動相。4)一般情況下，流動相沖洗20-30分鐘后，儀器和基線穩(wěn)定，方可進(jìn)樣測試。5)同時進(jìn)兩針標(biāo)樣，若結(jié)果的比值在0.98-1.02之間，可正式進(jìn)樣。6)測試結(jié)束，要進(jìn)行色譜儀及色譜柱的清洗和維護(hù)。如流動相為緩沖試劑，要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機(jī)相進(jìn)行保護(hù)，否則，有損色譜柱。7)關(guān)機(jī)時，先關(guān)計算機(jī)，再關(guān)液相色譜。第19頁，講稿共21頁，2023年5月2日，星期三注意事項：1)流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。2)脫氣后的流動相不要振動，盡量不引起氣泡。3)不使用不過濾的液體，所有過柱子