多重耐藥銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺類相關(guān)耐藥基因研究

多重耐藥銅綠假單胞菌β－內(nèi)酰胺類相關(guān)耐藥基因研究【摘要】目的調(diào)查我院2005年臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)的耐藥性分析并探討其耐藥基因的存在狀況。方法對(duì)31株臨床分離的銅綠假單胞菌用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其藥敏表型，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶編碼基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并與相關(guān)藥敏表型比較。結(jié)果31株銅綠假單胞菌對(duì)16種抗菌藥物的耐藥率為48．4%~100%；β-內(nèi)酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。結(jié)論本院多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐藥主要與外膜通道蛋白OprD2基因缺失有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內(nèi)酰胺酶；聚合酶鏈反應(yīng)；基因型

【Abstract】ObjectiveTosurveythedistributionofaminoglycoside-modifyingenzymegenesinmultidrug-resistantpseudomonasaeruginosaisolatedinourhospitalin2005．MethodsTheantibioticsusceptibilityof31differentantibioticsofwastestedbyK-Bmethod，and31multi-drugresistantstrainswerescreened;β-lactamasegenesandtheoutermembraneproteinOprD2geneweredetectedbypolymerasechainreaction(PCR).ResultsResistantratesof31strainsofagainst16kindsofantibioticrangedfrom48．4%to100%;thedetectionrateofβ-lactamasegenePER，VIM，DHA，IMP，TEMandOXA-10was6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and3．2%respectively，andnoneofthe31strainspossessedgenesofGES，SHVandVER，31isolateofPAlosttheoutermembraneproteinOprD2Resistancetoβ-lactamcompoundsinofourhospitalisrelatedtolosttheoutermembraneprotein.

【Keywords】Pseudomonasaeruginosa;Multidrugresistance;β-Lactamases;Polymerasechainreaction;Genes

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)是一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病。2002年全國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)調(diào)查顯示：PA的分離率為10．3%，僅次于大腸埃希菌而居第二位[1]。由于臨床上抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌呈現(xiàn)出天然或獲得性多重耐藥性(multidrugresistance，MDR)，給治療造成困難。近年來(lái)，銅綠假單胞菌對(duì)3、4代頭孢和亞胺培南在內(nèi)的多種β內(nèi)酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素耐藥率一直處于一個(gè)比較高的水平，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1-3]。為了解臨床分離多重耐藥的PA中耐藥情況，收集了本院2005年1~12月臨床分離的31株P(guān)A，對(duì)其進(jìn)行耐藥性的檢測(cè)，并采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)其耐藥相關(guān)基因，結(jié)果報(bào)告如下。

1材料

1．1菌株來(lái)源于本院2005年1~12月臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)31株。所有標(biāo)本均采用法國(guó)生物梅里埃公司細(xì)菌鑒定儀鑒定菌種。

1．2質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1．3MH培養(yǎng)基采用英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1．4抗生素及藥敏紙片頭孢他啶(30μg/片，CAZ)、頭孢曲松(30μg/片，CRO)、亞胺培南(10μg/片，IMP)、克拉維酸(2mmol/L，CA)、氯唑西林(2mmol/L)、美羅培南(10μg/片，MER)、2-巰基丙酸紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1．5微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-32法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1．6儀器DNA擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品。

1．7PCR檢測(cè)試劑盒由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

2方法

2．1細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和保存細(xì)菌培養(yǎng)根據(jù)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程按常規(guī)方法進(jìn)行，采用VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果；將細(xì)菌接種于半固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后置-80℃冰箱保存，以備進(jìn)行分子學(xué)檢測(cè)。

2．2抗生素敏感試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)2004年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

2．3PCR擴(kuò)增模板制備挑取菌落置入含100μl生理鹽水的0．5ml離心管內(nèi)，15000轉(zhuǎn)/min離心5min，去上清。加0．05%非離子去污劑NP4050μl、200ng/ml的蛋白酶K2μl混勻，55℃水浴1h，然后95℃水浴5min，最后10000轉(zhuǎn)/min離心30s，取上清做PCR擴(kuò)增的模板。

2．4基因檢測(cè)均為PCR法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物500bp熱循環(huán)參數(shù)均為：93℃預(yù)變性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5min，其余均為：93℃預(yù)變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5min。各種靶基因的目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

2．5擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠(含0．5μg/ml溴化乙錠)120V電泳30~40min，全自動(dòng)凝膠圖像成像儀觀察，出現(xiàn)與陽(yáng)性模板分子量相同的條帶即為陽(yáng)性，PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照DNA，由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所微生物DNA收集與保存室提供，擴(kuò)增條件同上。

3結(jié)果

3．1藥敏試驗(yàn)結(jié)果31株銅綠假單胞菌對(duì)16種抗菌藥物的藥敏率見表2。

3．2基因檢測(cè)結(jié)果β內(nèi)酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。

4討論

研究發(fā)現(xiàn)，PA對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素存在多種耐藥機(jī)制，如外膜滲透性降低、泵出機(jī)制、由染色體編碼持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶以及能水解卡巴培能碳?xì)涿赶┑慕饘倜傅?。IMP是目前用于治療革蘭陰性桿菌感染具有最強(qiáng)抑菌效能的抗生素，對(duì)產(chǎn)ESBLs及AmpC酶的革蘭陰性桿菌均有效。IMP耐藥的PA在臨床上具有更大的危險(xiǎn)性。

近年來(lái)隨著研究的深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在PA菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了多種β內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM、SHV[6，7]、OXA、VEB-1、PER[8，9]、GES、持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶、IMP[10]、VIM[11]、SPM[12]等。在我國(guó)上海、杭州、石家莊、溫州相繼發(fā)現(xiàn)了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因[6，8，10]。這些基因所表達(dá)的產(chǎn)物可以水解青霉素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳青霉烯類抗生素。

本組菌株中，表型耐亞胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失為100%；VIM、IPM基因各發(fā)現(xiàn)1株，各占3．2%。PA對(duì)亞胺培南耐藥的主要原因?yàn)楫a(chǎn)IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶、GES-2型β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)PA的作用靶位是細(xì)菌內(nèi)膜上的PBP2，該類藥物要達(dá)到其作用靶位必須首先經(jīng)過(guò)外膜通道進(jìn)入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達(dá)其作用靶位，細(xì)菌將產(chǎn)生耐藥。因此，OprD2被認(rèn)為是亞胺培南擴(kuò)散的通道[11]。VIM、IMP是金屬β-內(nèi)酰胺酶，可快速水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗菌藥物。通過(guò)本組實(shí)驗(yàn)研究可以表明PA對(duì)亞胺培南耐藥的主要原因是特異性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，從而阻礙抗菌藥物進(jìn)入菌體內(nèi)到達(dá)細(xì)菌作用靶位。

OXA、TEM、SHV、PER、GES陽(yáng)性均可引起PA對(duì)β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物的廣泛耐藥。本組菌株中PER的陽(yáng)性率為6．4%，TEM、OXA-10的陽(yáng)性率為3．2%，而GES、SHV基因未檢出，這些基因的陽(yáng)性率與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果有差別[6，8，10]。導(dǎo)致此種結(jié)果出現(xiàn)的原因應(yīng)與本地區(qū)抗菌藥物的使用情況有密切關(guān)系。

總之，PA的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，它對(duì)某一類抗菌藥物的耐藥往往不是由單一因素造成，而常是幾種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果；它對(duì)不同抗菌藥物的耐藥機(jī)制也不完全相同，并不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn)。即使是同一種菌不同地區(qū)、不同時(shí)期其耐藥性和耐藥基因狀況也不相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明聊城地區(qū)的PA對(duì)各類抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且耐藥基因陽(yáng)性率較有報(bào)道的國(guó)內(nèi)其他地區(qū)高。OprD2基因缺失應(yīng)該是本組菌株耐藥的主要原因，此情況應(yīng)引起臨床醫(yī)生和院內(nèi)感染科的高度重視，但也不排除同時(shí)存在其他耐藥機(jī)制的可能，有待進(jìn)一步研究。

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