生物工藝學(xué)胡慶森編安徽科技

生物工藝學(xué)胡慶森qshu@生命科學(xué)學(xué)院本課程的主要內(nèi)容和考核方式菌種選育（第2章）微生物代謝調(diào)節(jié)（第3章）微生物培養(yǎng)基及滅菌（第4、5章）種子擴大培養(yǎng)（第6章）發(fā)酵工藝控制（第7章）平時成績：20%（出勤率、課堂表現(xiàn)、課后習(xí)題）期末考試：80%（閉卷，平時上課講解的重點內(nèi)容）主要內(nèi)容通過理解所學(xué)的知識，達到重點內(nèi)容熟練掌握，具有初步分析和解決本專業(yè)問題的能力。緒論（第1章）第一章緒論第一節(jié)生物技術(shù)的概念與特點

IECDO給出的定義：應(yīng)用自然科學(xué)和工程學(xué)的原理，依靠生物作用劑（biologicalagents）的作用將物料進行加工以提供產(chǎn)品或用以為社會服務(wù)的技術(shù)。特點：①一門多學(xué)科、綜合性的科學(xué)技術(shù)②反應(yīng)過程中需要生物催化劑的參與③最終目的是建立在工業(yè)生產(chǎn)過程或進行社會服務(wù)。(Moo-Young,1985)

生物學(xué)化學(xué)工程學(xué)生物技術(shù)1.2生物技術(shù)的發(fā)展歷史（四個階段）代表性的產(chǎn)品或技術(shù):在石器時代后期，我國人民利用谷物釀酒，公元10世紀,我國就有了預(yù)防天花的活疫苗。公元前221年（周代后期），作豆腐、醬和醋，另外還有泡菜、奶酒、干酪等制作以及面團發(fā)酵、糞便和秸桿的漚制等。特點

知其然不知其所以然，有關(guān)實踐沒有上升到理論，更不能以理論來指導(dǎo)提高、實踐。經(jīng)驗生物技術(shù)時期（從人類出現(xiàn)到19世紀中期）近代生物技術(shù)建立時期（19世紀50年代至20世紀40年代）這一時期的誕生與顯微鏡的發(fā)明、微生物的發(fā)現(xiàn)和微生物學(xué)的問世密切相關(guān)。1683年，荷蘭人列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)制作顯微鏡，人們認識到微生物的存在。

Leeuwenhoek在1683年寄給英國皇家協(xié)會信的部分內(nèi)容。

A和B代表桿菌，C和D表示菌體運動的軌跡，E代表球菌

F代表長桿菌，G代表螺旋菌，H代表一簇球菌1863年“微生物學(xué)之父”法國人巴斯德（L.Pasteur）指出所有的發(fā)酵都是微生物作用的結(jié)果。（Pasteurization；利用減毒的病原菌制成疫苗）

1881年細菌學(xué)奠基人德國的科赫（R.Koch）首先用染色法觀察細菌形態(tài)（固體培養(yǎng)皿表面劃線培養(yǎng)獲得單孢子菌落；發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌）。1926年美國的薩姆納（J.B.Summer）首次證實結(jié)晶脲酶是蛋白質(zhì)劃線分離獲得單菌落青霉素抑菌實驗1928年英國人弗萊明（A.Fleming）發(fā)現(xiàn)青霉素產(chǎn)品特點：以厭氧發(fā)酵居多，不少工業(yè)過程陸續(xù)出現(xiàn)產(chǎn)物多數(shù)屬于微生物初級代謝產(chǎn)物，主要與細胞生長相關(guān)的產(chǎn)物及能量代謝相關(guān)的副產(chǎn)物。產(chǎn)品類型：有機溶劑乙醇、丙酮-丁酮-乙醇、丙酮-丁酮-異丙醇多元醇甘油有機酸乳酸、乙酸、丙酸、丙酮酸、檸檬酸、富馬酸酶制劑淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、凝乳酶疫苗卡介苗該階段的特點：微生物學(xué)通過對微生物形態(tài)和生理的觀察與研究建立的時期，為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)開始做出比以往更多的貢獻，出現(xiàn)了不少新品種和新成就。早期以固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)

近代生物技術(shù)的全盛時期（20世紀40年代-20世紀70年代）

出現(xiàn)于20世紀40年代，是以青霉素的工業(yè)開發(fā)獲得成功為標志。最初采用表面培養(yǎng)生產(chǎn)，以麩皮為培養(yǎng)基，發(fā)酵效價單位約為40u/mL，純度20%，收率30%。1943年，美英科學(xué)家研究出5m3的機械通風(fēng)發(fā)酵罐，采用深層培養(yǎng)法使發(fā)酵效價為200u/mL

，純度60%，收率75%。機械攪拌和通氣裝置的發(fā)酵罐代替扁瓶或錐形瓶

不久其他抗生素如鏈霉素、新霉素相繼問世。很快又發(fā)展了其他發(fā)酵產(chǎn)品，如維生素（19世紀40年代）、氨基酸（19世紀50年代）、酶制劑（19世紀60年代）

、核苷酸、多糖、有機酸。

本階段形成兩項技術(shù)：固定化酶（細胞）技術(shù)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。固定化技術(shù)應(yīng)用實例生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在兩步法生產(chǎn)Vc中應(yīng)用

現(xiàn)代生物技術(shù)建立和發(fā)展時期（從20世紀70年代末開始）

以分子生物學(xué)理論為先導(dǎo)，基因工程的技術(shù)能作為生物技術(shù)新產(chǎn)品的一項開發(fā)手段和關(guān)鍵技術(shù)算起。

1974年美國人H.W.Boyer和S.N.Cohen在實驗室內(nèi)首次成功獲得基因的克隆。

1944年美國微生物學(xué)家O.T.Avery證明了基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA。1953年美國J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA雙螺旋模型。1958年F.H.C.Crick發(fā)現(xiàn)中心法則。1961-1965M.W.Nirenberg，R.W.Holley,H.G.Khorana完成常見氨基酸密碼子的破譯。

1982年美國Eli-Lilly藥廠第一個基因工程產(chǎn)品胰島素投入市場。1.目的基因的獲取2.載體的選擇3.目標基因與載體NDA的體外連接4.重組體DNA導(dǎo)入受體細胞5.重組細胞的篩選和鑒定基因工程的基本操作步驟基因工程產(chǎn)品發(fā)展概況目前，世界上已經(jīng)批準上市的基因工程藥物就有幾十種，集中在多肽或蛋白質(zhì)的生化藥物中，如：胰島素、人生長激素等。部分利用基因工程技術(shù)研制的產(chǎn)品人胰島素

人生長激素(GH)

表皮生長因子(EGF)

腫瘤壞死因子

白細胞介素-2(IL-2)

尿激酶原

豬生長激素(PGH)

牛生長激素(BGH)纖維素酶

,-干擾素

乙型肝炎疫苗

集落刺激因子(CSF)

紅細胞生成素(EPO)

抗血友病因子

組織溶纖原激活劑(t-PA)

這一時期出現(xiàn)了一項屬于細胞工程的巨大成就-單克隆抗體技術(shù)。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細胞融合，基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。

脾臟淋巴細胞骨髓瘤細胞繁殖快速產(chǎn)生目的抗體基因雜交瘤細胞繁殖快速+產(chǎn)生目的抗體基因動、植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：動物細胞生產(chǎn)單克隆抗體、糖蛋白干細胞的培養(yǎng)雜交技術(shù)在動、植物生產(chǎn)中應(yīng)用：“三系雜交水稻”轉(zhuǎn)基因動、植物的研究和開發(fā)：“金稻米”“克隆羊”、“克隆?！?、“克隆鼠”

生物技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢第二章微生物代謝調(diào)節(jié)第一節(jié)微生物初級代謝調(diào)節(jié)代謝調(diào)控機制分為兩種主要的類型：酶活的調(diào)節(jié)和酶合成的調(diào)節(jié)?？焖傧鄬徛富畹恼{(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)活化或鈍化誘導(dǎo)或阻遏微調(diào)粗調(diào)本章以下內(nèi)容圍繞微生物細胞如何實現(xiàn)這兩種調(diào)節(jié)方式展開論述蛋白質(zhì)水平基因水平代謝調(diào)節(jié)的部位第一節(jié)酶活性調(diào)節(jié)1.定義：蛋白質(zhì)分子中的一個或者多個氨基酸殘基與一化學(xué)基團共價連接或者解開，使其活性改變的作用。2.化學(xué)基團：磷酸基、甲基、乙基、腺苷?；５鞍踪|(zhì)的共價結(jié)合部位：一般為絲氨酸殘基上的羥基（-CH2OH）。3.共價修飾的分類：可逆共價修飾、不可逆共價修飾。1、共價修飾酶活性調(diào)節(jié)可以歸納為以下幾種方式：共價修飾、變構(gòu)效應(yīng)、締合與解離、競爭性抑制。a、可逆共價修飾大多數(shù)共價調(diào)節(jié)是通過特定部位的絲氨酸、蘇氨酸的側(cè)鏈（-OH）的磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)的。磷酸化酶酶原：必須在一定條件下，去掉一個或者幾個特殊的肽鍵，從而使酶的構(gòu)象發(fā)生一定的變化才有活性。b、不可逆共價修飾如：胰蛋白酶原的活化

是通過腸肽酶在胰蛋白酶原N-端除去一個己肽。變構(gòu)蛋白(變構(gòu)酶)至少存在2個結(jié)合位點：活性位點+效應(yīng)物結(jié)合位點當(dāng)效應(yīng)物與變構(gòu)酶上的效應(yīng)物結(jié)合位點結(jié)合后，酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，引起催化中心改變，從而引起酶活性的變化（酶分子結(jié)合的效應(yīng)物不同，產(chǎn)生不同的效應(yīng)）。

2、變構(gòu)控制（P64-65）變構(gòu)效應(yīng)是反饋抑制的理論基礎(chǔ)，是代謝調(diào)節(jié)的有效方法。加正效應(yīng)物加負效應(yīng)物不加酶（有活性）酶（無活性）終產(chǎn)物終產(chǎn)物（調(diào)節(jié)物）結(jié)合在效應(yīng)物結(jié)合位點變構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)示意圖

3、締合與解離能進行這種轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)由多個亞基組成，蛋白質(zhì)活化與鈍化是通過組成它的亞基單位的締合與解離實現(xiàn)的。這類互相轉(zhuǎn)變鈍化是由共價修飾或若干配基締合啟動的。4、競爭性抑制一些蛋白質(zhì)的生物活性受代謝物的競爭性抑制。NAD+與NADH葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP己糖激酶酶活調(diào)節(jié)方式小結(jié)共價修飾變構(gòu)控制締合與解離競爭性抑制酶活調(diào)節(jié)可逆共價修飾不可逆共價修飾（磷酸化酶）（胰蛋白酶原激活）（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶）反饋抑制

?

一定數(shù)量的酶，通過其分子構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)其催化反應(yīng)的速率,特點是反應(yīng)快速。（ATPvs

ADP;NADHvsNAD）酶合成調(diào)節(jié)：主要指通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機制。這類調(diào)節(jié)是在基因水平（原核生物主要在轉(zhuǎn)錄水平上）上進行。第二節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)酶合成調(diào)節(jié)的方式酶合成的誘導(dǎo)酶合成的阻遏分解代謝物阻遏終產(chǎn)物阻遏定義：培養(yǎng)基中某種基質(zhì)與微生物接觸而增加（誘導(dǎo)）細胞中其相應(yīng)酶的合成速度。按照酶的合成與環(huán)境影響的關(guān)系來分，若酶的合成速度受基質(zhì)濃度變化的影響很小，這種酶稱為組成酶（如EMP途徑中的酶），反之，稱為誘導(dǎo)酶（如β-半乳糖苷酶）。1、誘導(dǎo)作用（induction）誘導(dǎo)物：是指能起誘導(dǎo)作用的化合物。誘導(dǎo)物常見的類型：基質(zhì)、基質(zhì)衍生物、產(chǎn)物

?誘導(dǎo)作用可以保證能量和氨基酸不浪費，不把它們用于制造那些無用的酶；但是如有需要可迅速合成。安慰誘導(dǎo)物：酶基質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，它們不能作為基質(zhì)被酶代謝，卻是出色的誘導(dǎo)物。異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）誘導(dǎo)作用的分子機制（P70）：

Jacob與Monod最先提出誘導(dǎo)作用模型，也叫操縱子模型。

RPOSS調(diào)節(jié)基因啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因操縱子是一組功能上相關(guān)的基因，由啟動基因（Promoter）、操縱基因（Operater）、結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）三部分構(gòu)成。

P-RNA聚合酶結(jié)合位點；O-調(diào)節(jié)RNA聚合酶啟動或停止轉(zhuǎn)錄的調(diào)控位點，該基因不能轉(zhuǎn)錄和翻譯；S-負責(zé)編碼有關(guān)酶蛋白的氨基酸序列；R-調(diào)控O，能編碼一種蛋白質(zhì)（阻遏蛋白或阻遏物），該蛋白質(zhì)專一性強，只能與特定操縱基因結(jié)合。乳糖操縱子調(diào)控示意圖阻遏蛋白具有活性（負調(diào)節(jié)）（a）無乳糖時（b）有乳糖時2、分解代謝物阻遏（P65-66）定義：培養(yǎng)基中某種基質(zhì)的存在會減少（阻遏）細胞中其相應(yīng)酶的合成速率，這種現(xiàn)象稱為分解代謝物阻遏。現(xiàn)象：若微生物的培養(yǎng)基中存在一種以上可利用的養(yǎng)分，通常它們會先分解那些最易利用的基質(zhì)，只有該基質(zhì)耗竭后才開始分解第二種基質(zhì)(如大腸桿菌在葡萄糖和乳糖上混合碳源中生長)。葡萄糖效應(yīng)：葡萄糖降解產(chǎn)物對其他分解代謝操縱子的阻遏作用稱為分解代謝物阻遏（降解物阻遏）。?實質(zhì)：容易利用的底物在分解過程中產(chǎn)生的中間代謝物或末端代謝物過量積累，阻礙了代謝中某些酶的合成。蛋白質(zhì)（mg/mL）鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（U/mL）鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的分解代謝物阻遏①3’-5’環(huán)腺苷單磷酸（cAMP）;

②微生物細胞內(nèi)存在一種蛋白質(zhì)，稱為受體蛋白（CRP）又稱為降解物基因活化蛋白（CAP）;③RNA聚合酶和模板NDA的結(jié)合以及mRNA合成的開始，都需要有cAMP和CRP同時存在。分解代謝物阻遏作用的分子機制（P70）：

?分解代謝物阻遏是由于cAMP的不足造成的，這是因為支持低生長速率的碳源比迅速利用的碳源造成細胞內(nèi)更高的cAMP☆大腸桿菌利用葡萄糖造成細胞內(nèi)cAMP含量過低，cAMP無法與受體蛋白CAP結(jié)合成復(fù)合物，導(dǎo)致RNA聚合酶無法結(jié)合到操縱基因位點，分解乳糖的相關(guān)酶基因不能正常進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此當(dāng)葡萄糖存在時，菌株表現(xiàn)為不能利用乳糖。酶合成調(diào)節(jié)的方式酶合成的誘導(dǎo)(β-半乳糖苷酶)酶合成的阻遏分解代謝物阻遏(二次生長)終產(chǎn)物阻遏（隨后講解）酶合成調(diào)節(jié)小結(jié)反饋調(diào)節(jié)反饋調(diào)節(jié)反饋抑制（酶活調(diào)節(jié)）反饋阻遏（酶合成調(diào)節(jié)）分解代謝物阻遏終產(chǎn)物阻遏★反饋抑制：指代謝途徑的終產(chǎn)物對催化該途徑的一個反應(yīng)（通常是第一個反應(yīng)）的酶活力的抑制。其實質(zhì)是終產(chǎn)物結(jié)合到酶的效應(yīng)物結(jié)合位點（變構(gòu)部位），從而影響酶與底物的結(jié)合，當(dāng)然與此相反的有酶活性的激活?！罘答佔瓒簦褐附K產(chǎn)物（或終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物）阻擾催化該途徑的一個（或幾個）反應(yīng)中的一個（或幾個）酶的合成。其實質(zhì)是調(diào)節(jié)基因的作用，這是微生物不通過基因突變而適應(yīng)于環(huán)境改變的一種措施，當(dāng)然與此相反的有酶合成的誘導(dǎo)。反饋抑制和反饋阻遏的比較終產(chǎn)物阻遏現(xiàn)象：微生物合成代謝過程中某些化合物（如氨基酸、核苷酸）不能無限量生成。終產(chǎn)物阻遏調(diào)節(jié)機制：阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄起始的阻遏作用色氨酸操縱子調(diào)節(jié)模型(P70)阻遏蛋白無活性?（a）低濃度色氨酸（b）高濃度色氨酸色氨酸衰減器模型(P71)即使形成轉(zhuǎn)錄mRNA,微生物仍可以通過衰減器模型在mRNA水平上控制此mRNA的轉(zhuǎn)錄衰減子：結(jié)構(gòu)基因之前，位于前導(dǎo)區(qū)內(nèi)，能使轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列。

衰減子前導(dǎo)肽核蛋白體衰減子結(jié)構(gòu)RNA聚合酶5'mRNA10、11位Trp密碼子1234UUUU3'DNADNA前導(dǎo)肽5'1234Trp結(jié)構(gòu)基因MKAIFVLKGMKAIFVLKGWWRTSRNA聚合酶

Trp操縱子的轉(zhuǎn)錄衰減機制（a）高濃度Trp（b）低濃度Trp決定轉(zhuǎn)錄終止的主要因素酶活性調(diào)節(jié)的其他方式：共價修飾、變構(gòu)效應(yīng)、締合與解離、競爭性抑制微生物調(diào)節(jié)機制小結(jié)反饋調(diào)節(jié)1.直線式代謝途徑中的反饋調(diào)節(jié)：

2.分支代謝途徑中的反饋調(diào)節(jié)：

在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個分支上的產(chǎn)物過多時不致同時影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。

主要有：同功酶調(diào)節(jié)，順序反饋調(diào)節(jié)，協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，積累反饋調(diào)節(jié)等。終產(chǎn)物作為調(diào)節(jié)因子通過反饋抑制限速酶或作為輔助阻遏物阻遏限速酶的合成同功酶反饋調(diào)節(jié)同功酶：同功酶是幾種在一個細胞中催化同一反應(yīng)的酶。該模式中分支末端的產(chǎn)物可分別專一性地對同工酶中的某一個發(fā)生反饋作用。P66圖3-6ABC

E2E1E3E4反饋調(diào)節(jié)反饋調(diào)節(jié)DEYFGZ特點：途徑中的第一個反應(yīng)（A至B）被兩個不同的酶（E1，E2）所催化，一個酶被Y反饋調(diào)節(jié)，另一個酶被Z反饋調(diào)節(jié)。只有當(dāng)Y和Z同時過量才能完全阻止A轉(zhuǎn)變?yōu)锽。

特點：末端產(chǎn)物Y和Z單獨過量，對途徑中第一個酶E1無反饋調(diào)節(jié)作用或產(chǎn)生很小的影響，只有Y和Z同時過量，才能對E1具有反饋調(diào)節(jié)作用。ABC

E1D

E

YFGZE3E2反饋調(diào)節(jié)協(xié)同反饋調(diào)節(jié)順序反饋調(diào)節(jié)P66圖3-6特點：兩個末端產(chǎn)物(Y,Z)，不能直接反饋調(diào)節(jié)途徑中的第一個酶Ea，而是分別反饋調(diào)節(jié)分支點后的Eb和Ec，造成中間產(chǎn)物C的積累，高濃度的C再反饋調(diào)節(jié)Ea。DEYFGZ

Eb

Ec抑制抑制抑制ABCEa特點：末端產(chǎn)物Y和Z單獨過量時，各自對途徑中第一個酶E1僅產(chǎn)生較小的抑制（或阻遏）作用，一種末端產(chǎn)物過量（Y或Z）并不影響其他末端產(chǎn)物的形成。只有當(dāng)Y和Z同時過量，才能對E1產(chǎn)生較大的抑制（或阻遏）作用。P66圖3-6ABCE1DEYFGZ40%30%58%細菌調(diào)節(jié)機制的多樣性芳香族氨基酸合成途徑中的反饋抑制和阻遏（P66圖3-7）EA莽草酸激酶EB分支酸變位酶第二節(jié)微生物次級代謝的調(diào)節(jié)1、微生物次級代謝相關(guān)的概念

?初級代謝：微生物提供能量、合成中間體及其關(guān)鍵大分子（如蛋白質(zhì)與核苷酸互相關(guān)聯(lián)的代謝）

?次級代謝：主要涉及合成過程，其終產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物對菌的生長不是必須，但對其生命活動可能具有某種意義，通常是在生長后期開始形成。

?次級代謝產(chǎn)物：抗生素、色素、生物堿、毒素等。次級代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)節(jié)在生產(chǎn)和理論上又有一定的應(yīng)用價值和研究意義。2、微生物次級代謝的特征①種類繁多，結(jié)構(gòu)特殊，含有不常見的化合物；如：抗生素、毒素、色素和生物堿等，如氨基糖、苯醌、香豆素、麥角生物堿、萜烯、四環(huán)類抗生素等；②含有少見的化學(xué)鍵；如：吩嗪、吡咯、喹啉、聚乙烯和多烯的不飽和鍵等；③一種微生物所含有的次級代謝產(chǎn)物往往是一組結(jié)構(gòu)相似的化合物（青霉素G,V,F,U,N）④一種微生物的不同菌株可以產(chǎn)生分子結(jié)構(gòu)迥異的次級代謝物(如灰色鏈霉菌可以產(chǎn)生7種抗生素)；不同種類的微生物也能產(chǎn)生同一種次級代謝物（至少有5類真菌能產(chǎn)生青霉素）；⑤次級代謝產(chǎn)物的合成比生長對環(huán)境因素更敏感。如菌體生長，磷酸鹽濃度0.3～300mmol/L；產(chǎn)物合成，磷酸鹽濃度0.1～10mmol/L，⑥一簇抗生素中各組分的多少取決于遺傳因素和環(huán)境因素;

♂初級代謝的特異性很高，而次級代謝合成所涉及的酶的特異性較低。

♀次級代謝的差錯對細胞的生長無關(guān)緊要，而初級代謝的差錯卻會引起致命后果。⑦次級代謝產(chǎn)物的合成過程是一類由多基因（基因簇）控制的代謝過程；這些基因不僅位于微生物的染色體中，也位于質(zhì)粒中，且后者的基因在次級代謝產(chǎn)物的合成過程中往往起主導(dǎo)作用。3、次級代謝產(chǎn)物的生物合成步驟①養(yǎng)分的攝入；②通過中樞代謝途徑（初級代謝）養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為中間體；③小分子建筑單位（前體，進入次級代謝）的形成；④如有必要，改變其中一些中間體⑤前體進入次級代謝生物合成的專有途徑；⑥在次級代謝的主要骨架形成后作最后的修飾，成為產(chǎn)物。中間體：對初級代謝而言；前體：對次級代謝而言；★有時二者是同一物質(zhì)，有時前體在中間體的基礎(chǔ)上結(jié)構(gòu)略有改變。?前體：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，能被微生物直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化，且具有促進產(chǎn)物合成的作用。?中間體：養(yǎng)分或基質(zhì)進入一途徑后被轉(zhuǎn)化為一種或多種不同的物質(zhì)，它們均被進一步代謝，最終獲得該途徑的終產(chǎn)物?！飪烧叩膮^(qū)別在于：前者的結(jié)構(gòu)往往要略需變化后才能進入代謝途徑，有時候兩者是同一種物質(zhì)。前體與誘導(dǎo)物區(qū)別：一般把那些能在生長期內(nèi)生產(chǎn)期前促進抗生素合成的化合物看做誘導(dǎo)物；而前體僅僅在生產(chǎn)期起作用。四、由初級代謝物衍生次級代謝物的途徑①糖類：葡萄糖碳架摻入途徑-差向異構(gòu)化、氨化、去羥基、重排、脫羧、氧化和還原②莽草酸、芳香氨基酸莽草酸途徑（芳香中間體）：莽草酸，對氨基苯甲酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸。③非芳香氨基酸（丙酮酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）④C1化合物⑤脂肪酸（乙酸、丙酸）⑥TCA循環(huán)的中間體⑦嘌呤和嘧啶（與核苷有關(guān)的途徑）次級代謝產(chǎn)物多數(shù)來源于以下幾種關(guān)鍵的觸及代謝產(chǎn)物，他們是初級代謝的中間體，可以作為次級代謝的前體。按Betina分類法五、微生物次級代謝的調(diào)節(jié)本小節(jié)主要以抗生素的生物合成闡述次級代謝的調(diào)節(jié)機理，其中多數(shù)概念也適用于非抗生素的次級代謝產(chǎn)物，如色素、毒素等。青霉素G苯乙酸1.酶的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)在次級代謝過程中，有些參與次級代謝產(chǎn)物合成的酶為誘導(dǎo)酶，如鏈霉素生物合成中的轉(zhuǎn)脒基酶、甘露糖鏈霉素酶等。誘導(dǎo)酶需要有誘導(dǎo)物存在才能形成。誘導(dǎo)物起誘導(dǎo)作用，能提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如，蛋氨酸能提高頭孢菌素C的產(chǎn)量，其原因是蛋氨酸的誘導(dǎo)作用，而不是作為硫源的供給物。次級代謝的一個特征是次級代謝物通常是在生長階段（營養(yǎng)期）之后的生產(chǎn)階段（分化期）合成。產(chǎn)物的形成是在某些營養(yǎng)成分從培養(yǎng)基中耗竭時開始的。易利用的糖、氨或磷酸鹽的消失使次級代謝物阻遏作用的解除。色氨酸誘導(dǎo)生物堿合成酶提高生物堿產(chǎn)量α－酮戊二酸＋乙酰CoA高檸檬酸順—高烏頭酸高異檸檬酸α－酮已二酸α－酮已二酸α-氨基已二酸（α-

AAA）賴氨酸L-α-

AAA

-半胱氨酸L-α-

AAA-半胱氨酸-D-纈氨酸青霉素G高檸檬酸合成酶反饋抑制2、反饋調(diào)節(jié)3、分解代謝物調(diào)節(jié)20世紀40年代初期就發(fā)現(xiàn)，青霉素發(fā)酵過程中，雖然葡萄糖被菌體利用最快，但對青霉素合成并不適宜。而乳糖利用雖然較為緩慢，卻能提高青霉素產(chǎn)量。使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用或者采用流加葡萄糖的策略，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。4、磷酸鹽調(diào)節(jié)磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物生物合成的重要因素。過量的磷酸鹽也象葡萄糖一樣抑制次級代謝產(chǎn)物的合成，這種抑制作用被稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。①過量磷酸鹽對四環(huán)素類、氨基糖苷類、多烯類和大環(huán)內(nèi)酯類等32種抗生素的生物合成產(chǎn)生阻抑作用。這些次級代謝產(chǎn)物的生物合成只有在適當(dāng)?shù)牧姿猁}濃度下才能進行。磷酸鹽濃度≥10mmol/L往往對次級代謝產(chǎn)物的合成有抑制作用。②磷酸鹽濃度的高低還能調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物合成期出現(xiàn)的早晚，當(dāng)磷酸鹽接近耗盡時，才開始進入次級代謝產(chǎn)物的合成期。磷酸鹽起始濃度高，耗盡時間長，合成期就向后拖延。如金霉素、萬古霉素等的發(fā)酵都有這些現(xiàn)象。5、能荷調(diào)節(jié)Atkinson把能荷定義為：細胞內(nèi)總的腺苷酸系統(tǒng)（即ATP,ADP,AMP之和）所負載的高能磷酸鍵數(shù)量，并規(guī)定細胞內(nèi)最高能荷為1.微生物初級代謝和次級代謝均存在能荷調(diào)節(jié)。能荷=[ATP]+0.5[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]ATP直接影響次級代謝產(chǎn)物合成和糖代謝中某些酶的活性。在四環(huán)素的生物合成中，ATP水平對四環(huán)素合成起調(diào)節(jié)作用。磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再經(jīng)羧基轉(zhuǎn)移酶作用生成丙二酰CoA（四環(huán)素合成的前體），此途徑在四環(huán)素合成期起決定作用。而草酰乙酸是三羧酸（TCA）循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和過量磷酸鹽的強烈抑制，從而降低了草酰乙酸的生成，最終降低了四環(huán)素生物合成前體丙二酰CoA的濃度，影響四環(huán)素的生物合成。第三章菌種選育第一節(jié)菌種的來源一、生物物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選1、微生物-生物產(chǎn)物的來源

要獲得所需生物特性的新產(chǎn)物關(guān)鍵是：微生物的選擇+采用什么樣的篩選方案2、待篩選樣品的性質(zhì)

次級代謝產(chǎn)物主要以液體培養(yǎng)法為篩選手段3、篩選方案的設(shè)計三種不同的篩選方法：整體細胞、完整細胞、亞細胞制劑選擇性分離方法大概分為五個步驟①含微生物材料的選擇（來源越廣泛的天然材料，含有目標微生物的可能性越大，表2-1）；②材料的預(yù)處理（加熱、過濾、離心等減少干擾因素，提高分離效果；表2-2）；③所需菌種的分離（分離效果取決于分離培養(yǎng)基的養(yǎng)分、pH、加入的抑制劑；表2-3）；④菌種的培養(yǎng)（放線菌在分離平板上不同溫度和培養(yǎng)時間進行培養(yǎng)）；⑤菌種的選擇和純化（鋪菌法和復(fù)印平板法）二、微生物選擇性分離的原理與發(fā)展以篩選產(chǎn)生抗生素的放線菌為例，介紹分離方法原理的發(fā)展第二節(jié)重要工業(yè)微生物的分離一、篩選潛在工業(yè)應(yīng)用價值的微生物時，宜考慮的重要指標：①菌株的營養(yǎng)條件(來源廣泛且廉價的培養(yǎng)基)②菌的生長溫度應(yīng)選擇高于30oC(降低冷卻成本)③菌對所采用的設(shè)備與生產(chǎn)過程的適應(yīng)性（易于工業(yè)化推廣）④菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度（經(jīng)濟效益的可行性）⑤易于從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物（下游提取精制的成本）投入生產(chǎn)前必須對其產(chǎn)物的毒性和菌種的性能做出評價。分離到一株優(yōu)良的菌株對隨后的工業(yè)化生產(chǎn)具有巨大的影響。二、施加選擇壓力的分離方法

（1）富集液體培養(yǎng)原理：對混合菌群采用“投其所好”“取其所抗”的策略進行篩選。在所需菌種占優(yōu)勢的情況下進行移種。a.分批富集法利用連續(xù)培養(yǎng)，通過改變限制性基質(zhì)的濃度來控制兩種菌的比生長速率b.連續(xù)富集法連續(xù)富集法篩選到的菌株特別適合連續(xù)培養(yǎng)有利于篩選到具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株（耐高溫、培養(yǎng)基簡單的菌株）篩選能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物(2)固體培養(yǎng)基的使用分離某些酶的產(chǎn)生菌時，選擇培養(yǎng)基中加入某種酶需要的基質(zhì)（3）隨機分離方法有些微生物的產(chǎn)物對產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性優(yōu)勢，常采用隨機的分離所需菌種。a.抗生素產(chǎn)生菌的篩選

如加入亞胺環(huán)己酮b.生長因子產(chǎn)生菌的篩選：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進營養(yǎng)缺陷型實驗菌生長。c.多糖產(chǎn)生菌的篩選:可從菌落的粘稠外觀識別這類產(chǎn)生菌。經(jīng)過自然界分離、篩選獲得的具有價值的菌株，在應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)之前必須經(jīng)過人工選育已得到具有一定生產(chǎn)能力的菌株。第三節(jié)菌種選育菌種選育的原因：發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展除了發(fā)酵工藝和設(shè)備的改進外，起決定作用是優(yōu)良菌株的獲得。菌種選育的方法1、經(jīng)典育種：自然選育和誘變育種2、定向育種：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控、基因工程特點：菌株篩選帶有一定盲目性特點：克服了盲目性，有理性的去篩選目的菌株一、自然選育1、定義：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌株的自然突變而進行的菌株篩選的過程。微生物堿基對自然突變的概率約為10-8-10-9，概率非常小。2、自然選育的一般流程制備單孢子（細胞）懸浮液適當(dāng)稀釋固體平板上分離菌株測定其生產(chǎn)能力選擇生產(chǎn)能力強的菌株優(yōu)點：

①自然選育操作簡單易行，

②可以純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定產(chǎn)量缺點:

①效率低、進展慢、

②很難大幅度提高產(chǎn)量

?自發(fā)突變的頻率較低，因此自然選育篩選出來的菌種，不能滿足育種工作的需要。因而不能僅停留在“選”種，還要進行“育”種。反復(fù)的篩選獲得優(yōu)良菌株二、誘變育種(1)誘變育種的原理點突變堿基置換移碼突變（幾個核苷酸發(fā)生插入或缺失）（一對堿基發(fā)生突變）染色體畸變?nèi)笔?、重?fù)、插入、易位、倒位（DNA分子大損傷）基因突變★誘變育種提高了菌株發(fā)生突變的頻率和變異幅度?。?）常用的誘變劑及其種類出發(fā)菌株的選擇工業(yè)上用來進行誘變處理的菌株，稱為出發(fā)菌株。菌懸液的制備誘變4.測定菌體存活率變異菌株的分離和篩選（3）誘變選育的一般步驟(4)誘變育種中幾個需要注意的問題a.選擇好的出發(fā)菌株挑選出發(fā)菌株的標準是產(chǎn)量高、對誘變劑的敏感性大，變異幅度廣。b.復(fù)合誘變劑的使用

?物理誘變與化學(xué)誘變相結(jié)合，提高誘變效果（如乙烯亞胺+紫外線）。

c.誘變劑劑量的選擇?能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動的劑量(多次實驗的摸索來確)。d.變異菌株的篩選

?盡量找出那些與產(chǎn)量相關(guān)的特性作為篩選的標準。

e.高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合（5）物理與化學(xué)誘變劑的使用方法（紫外線和亞硝基胍誘變）紫外線誘變：特點：危險性小，對野生菌株誘變效果好，應(yīng)用最為廣泛機制：形成胸腺嘧啶二聚體改變DNA生物活性操作要點：260nm波長照射菌懸液或孢子懸浮液，紫外燈功率15W,距離固定在15cm左右。亞硝基胍（NTG）誘變：特點：可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，有超誘變劑的稱號。較難溶解于緩沖液（甲酰胺溶解）操作要點：通常濃度300μg/mL，28oC,時間60min三、抗噬菌體菌株的選育a.抗噬菌體菌體菌株選育方法：自然突變法（不經(jīng)人工誘變，以噬菌體為篩子）誘變突變法噬菌斑細菌凡是有寄主細胞的地方，一般容易存在他們的噬菌體。誘變突變法基本步驟：先將敏感菌株誘變處理，將處理后的孢子液分離在含有高濃度噬菌體的平板上。根據(jù)抗性變異菌株能在此平板上生長，而將其挑選出來。b.抗噬菌體菌株的特性實驗通過上述兩種方法得到的抗噬菌體菌株，生產(chǎn)之前需要反復(fù)驗證，才能使用。①抗噬菌體形狀的穩(wěn)定性試驗②抗性菌株的產(chǎn)量試驗不但要具有抗性，還要求生產(chǎn)能力不低于原菌株。

Ⅰ.抗噬菌體菌株多次傳代后抗性是否穩(wěn)定。

Ⅱ.待測菌株分別在孢子（種子或發(fā)酵）培養(yǎng)過程中采用雙層瓊脂法檢測噬菌斑。③真正抗性與溶源性的區(qū)別實驗?真正抗性還是溶源性造成菌體對噬菌體具有抗性？用物理化學(xué)方法誘導(dǎo)敏感菌看能否形成噬菌斑。c.噬菌體的防治

以預(yù)防為主，同時采取篩選抗性菌株與保持環(huán)境衛(wèi)生、杜絕噬菌體滋生，兩者結(jié)合才是有效的防治措施。①正確判斷(根據(jù)發(fā)酵異常進行客觀聯(lián)系判斷)②普及有關(guān)噬菌體的知識(及時發(fā)現(xiàn)噬菌體)③選育抗噬菌體菌株④消滅噬菌體排氣口、下水道、車間中噬菌體的防治（漂白粉、甲醛、石灰水）；定時檢測噬菌體分布⑤收集與保存噬菌體為選育抗性菌株與研究防治提供素材四、雜交育種雜交育種：兩個不同基因型的菌株通過吻合（或結(jié)合）使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。微生物雜交所使用的配對菌株稱為直接親本，它們必須帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標記，如顏色、營養(yǎng)要求、抗藥性等。營養(yǎng)標記（營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標記之一。如細菌的雜交

A-B+Lac-SMrT1s(m)基本培養(yǎng)基上不生長A+B-Lac+SMsT1r(n)基本培養(yǎng)基上不生長A-B+Lac-SMrT1s+

A+B-Lac+SMsT1r基本培養(yǎng)基長出少量菌落細胞的接觸是發(fā)生基因重組的必要條件。五、原生質(zhì)體融合融合技術(shù)（1）原生質(zhì)體融合

就是把兩個親本的細胞壁分別通過酶解作用加以瓦解，使茵體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體(稱原生質(zhì)體)。兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇(PEG)作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。仍屬于半理性篩選(2)原生質(zhì)體融合的一般步驟與特點六、DNA重組技術(shù)

指按人的意志，將某一微生物（A）的遺傳物質(zhì)在體外經(jīng)人工與載體連接，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一個生物(B)體細胞中，使被引入的外源DNA片段在后者(B)內(nèi)部得以表達和遺傳。1、分子育種改良菌株主要的研究內(nèi)容：

①增加生物合成基因量②導(dǎo)入強啟動子和抗性基因而增加產(chǎn)量③把兩個不同的生物合成基因在體外重組再導(dǎo)入受體內(nèi)，產(chǎn)生雜交抗生素④激活沉默基因，生產(chǎn)新的生物活性物質(zhì)⑤異源基因?qū)胨拗髦斜磉_，徹底改變生產(chǎn)工藝2、3、工程菌穩(wěn)定性問題

（1）工程菌不穩(wěn)定性具體表現(xiàn)為下列三種形式：

①

②

③表達產(chǎn)物不穩(wěn)定

如人干擾素活性隨發(fā)酵時間而下降工程菌穩(wěn)定性能否解決，成為基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)樯a(chǎn)力的關(guān)鍵之一。（pBR322+pUB110）（pBR322）4、影響工程菌不穩(wěn)定的因素①重組質(zhì)粒的穩(wěn)定區(qū)受到影響，此外重組質(zhì)粒含有重復(fù)序列或與宿主染色體有部分同源。②宿主的比生長速率、宿主中重組基因的完整性。

③某些培養(yǎng)環(huán)境（高溫、SDS,某些藥物、胸腺嘧啶饑餓、紫外線輻射）都會引起質(zhì)粒丟失5、降低工程菌不穩(wěn)定的措施①組建合適的載體構(gòu)建質(zhì)粒時，插入一段特殊的DNA片段或基因②選擇合適的宿主大腸桿菌相對比較穩(wěn)定③施加選擇壓力（發(fā)酵過程中施加選擇壓力）抗生素添加法、抗生素依賴變異法、營養(yǎng)缺陷性型法、控制基因過量表達、控制培養(yǎng)條件、質(zhì)粒上不需要的DNA部分刪除、質(zhì)粒不含轉(zhuǎn)移因子、固定化重組菌七、菌種保藏一個優(yōu)良的菌種被選育出來以后，要保持其生產(chǎn)性能的穩(wěn)定、不污染雜菌、不死亡，這就需要對菌株進行保藏。盡量減少傳代次數(shù)，防止菌種衰退。(1)原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動處于休眠狀態(tài)。

低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，使菌體的代謝活性處于最低狀態(tài)，同時也應(yīng)考慮到經(jīng)濟、簡便方法。

①斜面冰箱保藏法短期過渡的保藏方法（3-6個月）②砂土管保藏法產(chǎn)孢子或芽孢的微生物（1年）③菌絲速凍法50%的甘油與菌懸液混合-20℃保存④石蠟油封存法不能利用石蠟油（1年左右）⑤真空冷凍干燥保藏法各種微生物（5年）

⑥液氮超低溫保藏法特別適合不產(chǎn)孢子的菌絲體（保存期長）(2)常用的菌種保藏方法第三章：微生物培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進產(chǎn)物的形成微生物的營養(yǎng)活動，是依靠向外界分泌大量的酶，將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，再借助于細胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營養(yǎng)來實現(xiàn)的。

第一節(jié)培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基按其組成物質(zhì)的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型一、按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基（復(fù)合培養(yǎng)基）:采用天然原料原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，（0.5%～0.8%）,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。

孢子培養(yǎng)基：

供菌體繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基（麩皮、大（?。┟着囵B(yǎng)基）要求：能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多的優(yōu)質(zhì)孢子，且不易引起菌種發(fā)生變異注意事項：①營養(yǎng)不要太豐富，否則不產(chǎn)孢子②無機鹽濃度要適量③控制培養(yǎng)基的pH和濕度三、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）

培養(yǎng)基按其用途可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種

種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽生長和大量繁殖菌絲體，并使長得粗壯，成為活力強的“種子”。

要求：營養(yǎng)比較完全和豐富，注意事項：①氮源等總濃度略稀薄為好②常同時使用有機氮源和無機氮源③最后一級的種子培養(yǎng)基成分最好接近發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基：

供菌體生長繁殖和合成產(chǎn)物之用。要求：除含有生長必須的元素之外，還要含有合成產(chǎn)物所必需的特定元素、前體和促進劑。第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源

一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；提供合成目的產(chǎn)物所需的碳成分。2、來源糖類、有機酸、正烷烴、油脂3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖

但是一次投入過量的葡萄糖容易抑制菌體生長和產(chǎn)物的合成。②糖蜜糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜來源和加工方法均影響其成分。③淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類（否則必須預(yù)處理）。缺點：?難利用、

?發(fā)酵液比較稠、一般濃度高于2.0%時需加入一定的α-淀粉酶優(yōu)點：?來源廣泛、價格低廉

?可以解除葡萄糖代謝過快帶來的負面效應(yīng)4、油和脂肪

該類化合物有比較活躍的脂肪酶，脂肪酶水解油或脂肪產(chǎn)生甘油和脂肪酸，進一步被氧化。5、有機酸乳酸、檸檬酸、乙酸6、烴類和醇類

①正烷烴（石油裂解得到的C14-C18直鏈烷烴混合物）已用于有機酸、氨基酸、維生素、抗生素、酶制劑的發(fā)酵工業(yè)中。

②“乙醇代糧發(fā)酵”生產(chǎn)單細胞蛋白二、氮源

氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH

生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源稱為生理酸性物質(zhì)，如硫酸銨。若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。所以，選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長

穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH2、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、

尿素、廢菌絲體和酒糟成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①含有多種氨基酸、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響三、無機鹽和微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，由實驗決定其用量五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。

對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻五、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑

發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些成分有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，這些添加的物質(zhì)包括：生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑。（1）生長因子

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子。來源：有機氮源含有豐富維生素B族元素和微量元素和一些微生物生長必不可少的生長因子。玉米漿的發(fā)現(xiàn)

前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。（2）前體青霉素苯乙酸前體的特點：①前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利

②菌體具有將前體分解的能力用法：前體使用時普遍采用流加的方法（減小毒性和增加利用率）（3）抑制劑和產(chǎn)物促進劑

所謂產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。

Tween（一種表面活性劑）是多種酶的促進劑。促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化1、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝的阻遏和誘導(dǎo)

合適的C、N比

pH的要求

微生物必須具備分解培養(yǎng)基的相關(guān)酶系，否則不能直接使用該培養(yǎng)基。如果要使用該培養(yǎng)基，必須對其進行一些列處理。酵母一般僅能利用C1-C3糖，最多C4糖國內(nèi)制曲釀酒工藝淀粉淀粉酶+糖化酶糖國外麥芽制酒工藝麥芽淀粉水解酶麥芽糖工業(yè)上將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化，所得到的糖液稱為淀粉水解糖。葡萄糖值，簡稱DE值（Dextroseequivalentvalue），表示淀粉水解程度的術(shù)語。其定義為：還原糖總量（按葡萄糖計）占試樣中干物質(zhì)質(zhì)量的分數(shù)。DE值越高，說明還原糖越多，淀粉水解越徹底。

菌種的同化能力不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大

代謝的阻遏和誘導(dǎo)

抗生素生產(chǎn)中種子培養(yǎng)基中被快速利用的碳氮源含量比發(fā)酵培養(yǎng)基要多酶制劑行業(yè)多數(shù)采用微生物利用緩慢的碳源（如淀粉、糊精等）代替微生物容易利用的碳源（如葡萄糖、果糖），避免分解代謝物阻遏的影響。有些產(chǎn)物如蛋白酶，通常受到培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)或多肽的誘導(dǎo)，而受到銨鹽、硝酸鹽、氨基酸的阻遏，這時在培養(yǎng)基中應(yīng)考慮有機氮源為主。

同一微生物處于不同生長階段，對氮源利用情況不同。初期銨鹽和氨基氮，中期有機氮無機氮混合使用。

合適的C、N比一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比為100:(0.2～2.0)N源過多菌體生長過于旺盛；pH

偏高；不利于產(chǎn)物形成N源過少菌體量不足；影響產(chǎn)量碳源過多容易造成pH偏低碳源不足容易引起菌體衰老和自溶

pH的要求除考慮培養(yǎng)基的營養(yǎng)外，也要考慮代謝后對培養(yǎng)體系pH的貢獻補加酸堿調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH谷氨酸發(fā)酵中C:N=100:15~21，若碳氮比為100:0.2~2.0，則會出現(xiàn)只長菌體，而不產(chǎn)谷氨酸的現(xiàn)象。③當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設(shè)計方法。

2、培養(yǎng)基設(shè)計的步驟①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；（1）理論轉(zhuǎn)化率與實際轉(zhuǎn)化率

理論轉(zhuǎn)化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。

實際轉(zhuǎn)化率是指實際發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率的大小

如何使實際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化率是發(fā)酵控制的一個目標。3、成分含量的確定

在青霉素分批發(fā)酵的一個簡單模型中，用于合成細胞、維持生命活力和轉(zhuǎn)化成青霉素的葡萄糖，分別占總糖耗量的28％、61％和11％。Cooney(1979)以青霉素生物合成的途徑為基礎(chǔ)，通過物質(zhì)和能量平衡，計算出青霉素生物合成的理論值?？偟幕瘜W(xué)計算式為