染色質(zhì)免疫沉淀

染色質(zhì)免疫沉淀Chromatinimmunoprecipitation第一頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件基因型決定(juédìng)表型第二頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件破壞(pòhuài)了基因型也就改變了表型第三頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件但是，也有一些(yīxiē)無(wú)法解釋的現(xiàn)象在相應(yīng)的基因堿基序列沒(méi)有發(fā)生變化的情況(qíngkuàng)下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。第四頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件什么(shénme)是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化(biànhuà)并不涉及DNA序列的突變。第五頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件表觀(biǎoɡuān)遺傳修飾

在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為“表觀遺傳修飾”，并被認(rèn)為是導(dǎo)致(dǎozhì)遺傳物質(zhì)一致的孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。第六頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)DNA與其包繞的核心組蛋白之間親和力的變化或相對(duì)位置的改變使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為松散，DNA更易于暴露。染色質(zhì)重塑就是通過(guò)這樣的變化來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由ATP提供能量的、通過(guò)依賴于ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與DNA的結(jié)合(jiéhé)狀態(tài)，在靠近核心組蛋白的DNA表面建立特殊的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因子較易于接近DNA的過(guò)程。第七頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(jìshù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步第八頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件實(shí)驗(yàn)(shíyàn)目的學(xué)習(xí)掌握(zhǎngwò)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟。第九頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件實(shí)驗(yàn)(shíyàn)原理第十頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件實(shí)驗(yàn)(shíyàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化準(zhǔn)備(zhǔnbèi)一瓶接近長(zhǎng)滿的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入37%的甲醛至終濃度為1%，輕輕搖勻，在37℃孵育10分鐘。

①甲醛的作用②細(xì)胞的用量③交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至4℃帶蛋白酶抑制劑PMSF的1×PBS洗細(xì)胞兩次，刮細(xì)胞到一個(gè)2ml離心管，2000rpm，4℃離心4min收集細(xì)胞。

第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件

甲醛的作用在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）的應(yīng)用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時(shí)間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過(guò)賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團(tuán)之間的交聯(lián)，高效地在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞(xìbāo)內(nèi)組分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠實(shí)地保留染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，在12-37℃作用30min。但是如果反應(yīng)溫度超過(guò)30℃，本底就可能增加。因此，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)減少作用時(shí)間或甲醛濃度。過(guò)度交聯(lián)將影響細(xì)胞的裂解，并且在超聲處理時(shí)不能獲得理想長(zhǎng)度的DNA片段及影響DNA的溶解。對(duì)于特別容易進(jìn)行交聯(lián)的目的蛋白質(zhì)（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件細(xì)胞的用量通常2.5×108細(xì)胞足夠進(jìn)行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。（一般分裝1х107細(xì)胞于一個(gè)EP管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。

交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響對(duì)于不同的細(xì)胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長(zhǎng)度或者交聯(lián)的溫度(wēndù)都需要調(diào)整。如果交聯(lián)不充分，會(huì)導(dǎo)致不完全固定，則DNA片段的平均長(zhǎng)度會(huì)小于500bp。交聯(lián)過(guò)度時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長(zhǎng)超聲波作用時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致重要原料的丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸并裂解細(xì)胞(xìbāo)，冰浴10分鐘；超聲波處理剪切染色質(zhì)DNA，使其形成300-1000bp即大約相當(dāng)于2-5個(gè)核小體長(zhǎng)度的片段；

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)②設(shè)置超聲破碎的條件③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)

超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而(jìnér)影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件②設(shè)置超聲破碎的條件超聲處理的條件通?？梢栽O(shè)置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時(shí)設(shè)置為最大功率的30%，采用2mm超聲頭。不同(bùtónɡ)的超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時(shí)，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致明顯發(fā)熱，然后摸索不同(bùtónɡ)的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個(gè)相對(duì)比較固定的超聲條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別MicrococcalNuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)DNA和DNA-蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用(cǎiyòng)沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定的NativeChIP（N-ChIP）的研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的MicrococcalNuclease處理的ChIP試劑盒（EZ-Enzyme）提供。第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件Enzyme和sonication處理結(jié)果比較(bǐjiào)第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件

超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可采用不同的超聲波處理?xiàng)l件，比較(bǐjiào)剪切效果。按以下步驟操作比較(bǐjiào)各種條件下的剪切效果：a.將超聲處理過(guò)的樣品離心收集上清（4℃13000rpm離心10分鐘），加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查。實(shí)驗(yàn)組12345678超聲次數(shù)3691136911超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁(yè)內(nèi)容不在正常的ChIP步驟中第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件酚/氯仿(lǜfǎnɡ)抽提步驟

按照1：1體積(tǐjī)比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入1/10體積3MNacl，2倍體積無(wú)水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心5min第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件5.將超聲處理過(guò)的樣品在4℃13000rpm離心10分鐘收集上清，10倍稀釋，將其移入一新(yīxīn)的2mlEP管中；6.按照每2ml稀釋后液體加入75μl的比例加入蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖動(dòng)30分鐘，預(yù)處理，短暫離心(700-1000rpm4℃，小于1分鐘)，收集上清液；

①Beads的選擇②Input的設(shè)置7.向2ml上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白H3的抗體(20μl)，4℃搖動(dòng)過(guò)夜，陰性對(duì)照組不加抗體同樣搖動(dòng)過(guò)夜；①抗體的選擇②對(duì)照的設(shè)置二、免疫沉淀染色質(zhì)DNA片段(piànduàn)第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件

①Beads的選擇(xuǎnzé)

利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體(kàngtǐ)通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magnabeads是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那樣容易破裂，所以在操作過(guò)程中更簡(jiǎn)單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。Millipore公司最新推出的MagnaChIP試劑盒就是采用這種Magnabeads。第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件免疫(miǎnyì)共沉淀和染色質(zhì)免疫(miǎnyì)沉淀input設(shè)置在進(jìn)行(jìnxíng)免疫沉淀步驟前的樣品第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件染色質(zhì)免疫沉淀抗體(kàngtǐ)的選擇ChIPValidated第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件②對(duì)照(duìzhào)的設(shè)置ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照：①未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理樣本（input）；②陽(yáng)性對(duì)照。一般用組蛋白抗體或anti-RNAPolymeraseII抗體這些比較(bǐjiào)保守的在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的蛋白的抗體；③陰性對(duì)照。即用一種無(wú)關(guān)抗體（或相應(yīng)動(dòng)物的免疫前血清），與抗目的蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；④選擇不與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照，即“基因組對(duì)照”。另外，還應(yīng)根據(jù)對(duì)ChIP的不同的特殊應(yīng)用設(shè)立不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。例如，試圖檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定突變細(xì)胞株中目的蛋白質(zhì)與基因組DNA結(jié)合情況時(shí)，必須用野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件8.加60μl蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖1小時(shí)；短暫離心(700-1000rpm，4℃，小于1分鐘)收集沉淀，分別用低鹽免疫復(fù)合物洗液、高鹽免疫復(fù)合物洗液、LiCl免疫復(fù)合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用1ml，搖動(dòng)3-5分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次三、PCR鑒定結(jié)合(jiéhé)于乙?；M蛋白H3的DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250μl洗脫液(1%SDS,0.1MNaHCO3)，震蕩，室溫孵育15分鐘，離心收集上清；第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件11.加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、和2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，取1μl作模板，按以下配方加樣，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以及Input組的GAPDH啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增條件95℃1分鐘，95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30個(gè)循環(huán)，72℃5分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢查結(jié)果。①此步DNA純化可以選擇(xuǎnzé)適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒②PCR的策略第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)。整理課件PCR的策略(cèlüè)

引物的選擇取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｈ缛翳b定目的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的位點(diǎn)，除了必須設(shè)計(jì)一對(duì)能使擴(kuò)增片段跨過(guò)該位點(diǎn)的引物外，至少還應(yīng)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增的DNA序列中沒(méi)有目的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)照引物。對(duì)于平均長(zhǎng)度為500bp的DNA分子，它的大部分片段長(zhǎng)度是500-1000bp，以至遠(yuǎn)離真正的結(jié)合位點(diǎn)1000