胰酶消化貼壁細胞

關于胰酶消化貼壁細胞第1頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三貼壁細胞:在體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長的細胞。如CHO細胞。消化：使經過分散的組織或貼壁的培養(yǎng)物相互或與介質解離，形成單細胞或小的細胞團的操作。第2頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三貼壁細胞的消化

貼壁細胞在培養(yǎng)瓶中長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，擴增、傳代。貼壁較緊的細胞如Hela，HepG2，CHO等，則需要以細胞消化液消化后，才能脫落和分散，擴瓶。常用的消化液為胰蛋白酶，EDTA等第3頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三主要消化方式一、酶消化法(胰酶Trypsin)二、離子螯合劑(EDTA)第4頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三一、酶消化法(胰酶Trypsin)1)胰酶消化原理:胰酶是一種蛋白酶。通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養(yǎng)皿壁結合處蛋白降解，使兩者分離。這時細胞由于自身內部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。

細胞消化用胰蛋白酶常用的工作濃度為0.25％，pH為7.2-7.4之間。第5頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三2)酶消化法操作過程：

（以下操作均必須嚴格按無菌操作的要求進行）

將長成致密單層細胞的細胞瓶中原來的培養(yǎng)液棄去；

加入0.25％胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定），以使充分浸潤；

第6頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三一般消化時間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細胞單層連接成片）轉為點狀透明（出現(xiàn)細小空隙）時，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。

第7頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三圖示：

CHO貼壁細胞

第8頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三經過48小時培養(yǎng)成為致密單層第9頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三加入0.25%胰酶后細胞逐漸皺縮變圓，細胞間隙增大不再致密

第10頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞明顯皺縮變小，細胞間隙增大不再致密，部分細胞維持正常形態(tài)，部分細胞皺縮變圓。第11頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞基本皺縮變圓此時細胞吹打可下

第12頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞完全皺縮變圓此時應棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細胞從細胞瓶壁上洗下，將細胞懸液用吸管吹散后傳代第13頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三有經驗后，可肉眼對光觀察貼壁半透明的細胞層，判斷消化程度。如消化過頭，會見到許多細胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失,甚至造成細胞破碎。也可以在倒數(shù)第二、三步時棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后一步的消化程度，這樣略有點過也影響不大第14頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三注意事項1．在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。2.在使用胰酶細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。第15頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三

3.胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差。消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。4.在37℃時,胰酶活性最強。第16頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三5.溶液中的Ca2+、Mg2+和血清中的非特異性胰蛋白酶抑制劑會降低胰酶活力消化過頭，所以加入有血清培養(yǎng)基可以終止反應第17頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三常見問題:用胰蛋白酶消化后，細胞還是成團，原因可能是什么？消化時間不夠；

吹打力度不夠；

胰酶消化液濃度不夠；

胰酶本身問題；

細胞密度過高;第18頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三二、離子螯合劑：（EDTA）1)EDTA消化原理:EDTA是一種螯合劑，因為細胞表面很多和培養(yǎng)皿結合的蛋白都帶有Ca2+,或者Mg2+，而EDTA就是螯合Ca2+,或者Mg2+的，從而加速細胞和培養(yǎng)皿的脫離。第19頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三2)EDTA消化液使用注意事項1.常用濃度在0.02%左右。2.在弱堿性條件下才易溶,配制時應調節(jié)好酸堿度。

3.EDTA能顯著影響PH值,且不會被終和,所以消化下來的細胞要拿PBS洗一遍第20頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三適用范圍

因為EDTA不破壞細胞表面分子，僅與Ca2+,Mg2+螯合。所以適用于需檢測細胞表面分子的細胞消化。第21頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞的保存第22頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞凍存:細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。細胞復蘇：將凍存的細胞解凍，再進行傳代培養(yǎng)。第23頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解以下幾個問題：冷凍速率復溫速率冷凍保護劑冷凍保存溫度第24頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三1、冷凍速率

冷凍速率是指降溫的速度，是活細胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。第25頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三2、復溫速率

復溫速率是指細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細胞復蘇時，復溫速率不當也會降低冷凍存活率。一般來說復溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內要完成復溫。第26頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三3、冷凍保護劑冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質，常被加到一定的溶液中進行配制，作為冷凍保護液。

常用的冷凍保護劑：ＤＭＳＯ第27頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三4、冷凍保存溫度

冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經長期保存和復蘇后仍能保持正常的結構和功能。從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度第28頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三

ＤＭＳＯ：是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

ＤＭＳＯ的濃度必須<=10%,大于這個濃度即使在低溫對細胞也有毒性作用。

有些細胞不能用DMSO，可用甘油。第29頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞凍存程序1．細胞凍存前24-48小時傳代培養(yǎng)，使細胞處于指數(shù)生長期．2．經胰酶消化后，加入適量培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液．3．加入新生牛血清．4．加入經過除菌過濾的ＤＭＳＯ．5．混勻第30頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三6．將懸液加入滅菌凍管中，1-2ml/支，嚴密封口后，注明細胞名稱．7．置4度冰箱中，30分鐘后轉入-20度冰箱中，30分鐘后轉入液氮口，４小時后轉入液氮中保存．8.復蘇一支細胞，檢測細胞活力及有無污染第31頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三細胞復蘇程序取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長培養(yǎng)基

.24小時細胞貼壁后換液.第32頁，講稿共34頁，2023年5月2日，星期三注意: