酵母菌的形態(tài)觀察大小測(cè)定和直接計(jì)數(shù)課件

關(guān)于酵母菌的形態(tài)觀察大小測(cè)定和直接計(jì)數(shù)第1頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三

目的要求：

1、觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌

死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

2、學(xué)習(xí)并掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。

3、掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。第2頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、基本原理：酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有性繁殖通過(guò)接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料。它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型。因此酵母活細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，以此進(jìn)行鑒別。一、.酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別第3頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三美藍(lán)浸片的觀察：（1）在載玻片中央加一滴0.05%呂氏堿性美藍(lán)染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均勻。（2）加蓋玻片。注：不要產(chǎn)生氣泡。（3）將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死、活細(xì)胞。2、操作技術(shù)第4頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三（4）染色約0.5h后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。（5）繪圖說(shuō)明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征，并計(jì)算0.5h后酵母菌的死亡率。

第5頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三酵母菌第6頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、基本原理

微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測(cè)定需借助測(cè)微尺---目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。二.微生物大小的測(cè)定第7頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三第8頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三第9頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三

鏡臺(tái)測(cè)微尺：

是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將1mm等分為100小格，每格長(zhǎng)0.01mm。用于校正目鏡測(cè)微尺每格的相對(duì)長(zhǎng)度。

目鏡測(cè)微尺：

是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，測(cè)量時(shí)，需要將其放在接目鏡中的隔板上，用以測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。

第10頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三

由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測(cè)微尺每小格代表的實(shí)際長(zhǎng)度也不一樣。因此，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng)度，然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際大小。球菌用直徑來(lái)表示其大?。粭U菌則用寬和長(zhǎng)的范圍來(lái)表示。第11頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）裝目鏡測(cè)微尺(換目鏡)把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的格板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測(cè)微尺：1）放鏡臺(tái)測(cè)微尺：將鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺(tái)上。2.操作技術(shù)第12頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三2）校正：先用低倍鏡觀察，將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰地看到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡進(jìn)行校正，測(cè)出在高倍鏡下，兩重合線之間兩尺所占的格數(shù)。第13頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三3）計(jì)算：目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（um）=兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)x10/兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)（3）菌體大小測(cè)定：目鏡測(cè)微尺校正完畢后，取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌染色制片。先在低倍鏡下找到標(biāo)本，換高倍鏡測(cè)定酵母菌的寬度和長(zhǎng)度。測(cè)定時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺和移動(dòng)載玻片，測(cè)出酵母菌的直徑或?qū)捄烷L(zhǎng)所占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)。最后將所測(cè)得的格數(shù)乘以目鏡測(cè)微尺（在高倍鏡下）每格所代表的長(zhǎng)度，即為該菌的實(shí)際大小。（4）測(cè)定完畢：取出目鏡測(cè)微尺后，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺分別用擦鏡紙擦試干凈，放回盒內(nèi)保存。第14頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。二、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法第15頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上有四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。第16頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三計(jì)數(shù)室規(guī)格：

25（中格）×16（小格）

16（中格）×25（小格）每種規(guī)格計(jì)數(shù)室中的小方格都是400個(gè)。計(jì)數(shù)室大?。?/p>

每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。第17頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三第18頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三25X1616X25第19頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）菌懸液制備以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。?）鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。（3）加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將要搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。2、操作步驟第20頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三（4）顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。第21頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三由此處注入第22頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三每一中方格的周圍皆有三條邊線，計(jì)算單一中方格的細(xì)胞數(shù)時(shí)，位于邊線上的細(xì)胞計(jì)算方式為：以第二條邊線(簡(jiǎn)稱中線)為界，接觸到左側(cè)中線與上端中線的細(xì)胞要算，接觸到右側(cè)與下端中線的細(xì)胞則不列入計(jì)算。如上圖，若每一個(gè)圓圈皆代表活細(xì)胞，空心的要算，而實(shí)心的不算。

第23頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三菌液濃度要適當(dāng)，一般樣品稀釋度要求每小格約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。第24頁(yè)，講稿共26頁(yè)，2023年5月2日，星期三（5）