(畢業(yè)論文)林蛙皮中提取膠原蛋白的方法比較正文終稿

長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文PAGE31摘要中國(guó)林蛙，屬于兩棲類(lèi)珍稀動(dòng)物。中國(guó)林蛙以其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值日益受到人們的重視，是蛙類(lèi)中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種。林蛙富含多種氨基酸、激素、微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，在藥用、滋補(bǔ)和美容等方面都具有非常高的利用價(jià)值。林蛙皮是摘取林蛙油后作為飼料或廢棄物的物質(zhì)。本研究立足于中國(guó)林蛙資源豐富以及蛙皮中含有大量生物活性物質(zhì)這一優(yōu)勢(shì)，以干燥的林蛙皮為原料，用不同方法對(duì)林蛙皮進(jìn)行膠原蛋白提取試驗(yàn)，利用羥脯氨酸比色法比較了幾種方法的提取效果，得出最佳的提法方法，并通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)最佳提取方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：酸法浸提是從林蛙皮中提取膠原蛋白的最佳方法，液料比為20:1，利用0.1mol/L檸檬酸在37℃下浸提48h為最佳工藝條件。關(guān)鍵詞：林蛙皮；膠原蛋白；方法比較；最佳工藝

AbstractRanachensinensis,belongstotheamphibianofrareanimals.Theranachensinensishasbeenpaidincreasinglyattentionbypeoplewithitsuniquenutritionvalueandmedicinalvalue,andbecomesoneofthefrogswhichhavemosteconomicvalue.Ranaisrichinaminoacids,hormones,traceelements,vitaminsandothernutritions,andhasveryhighvalueintheuseofpharmaceutical,tonic,cosmeticandotheraspects.Ranaskinisgatheringafterranaoilasfeedorwastematerial.Thisstudybasesontheadvantagethatranachensinensisresourcesarerichandranaskincontainsalotofbiologicalactivesubstance,withdryranaskinasrawmaterials,usingdifferentmethodstotheextractiontestbyranaskincollagen,thencomparedseveralmethodsofextractioneffectbyhydroxyprolinecolorimetricmethodtogetthebestextractionmethod，andthroughthesinglefactorexperimentandorthogonalexperiment,thebestextractionmethodisoptimized.Theresultsshowthat:acidextractionisthebestmethodofcollagenproteinextractedfromthefrogskin,liquidtosolidratio20:1，using0.1mol/Lcitricacidin37℃soaksraises48histhebesttechnologicalconditions.Keywords:Ranaskin;collagenprotein;comparisonofmethods;besttechnologicalconditions

目錄TOC\o"1-3"\h\u25947摘要 I3044Abstract II21309目錄 III1922第一章前言 123089第二章文獻(xiàn)綜述 2103332.1林蛙皮 3279362.1.1林蛙皮的功能 3192462.1.2林蛙皮中膠原蛋白 5157312.1.3林蛙皮研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景 6197192.2膠原蛋白 720682.2.1膠原蛋白的結(jié)構(gòu) 77072.2.2膠原蛋白的功效 850252.2.3膠原蛋白的應(yīng)用 1143362.2.4膠原蛋白的發(fā)展趨勢(shì) 13126002.3膠原蛋白的提取方法 14204692.3.1酸法 14236672.3.2堿法 1416692.3.3酶法 14155162.3.4鹽法 14216672.3.5熱水法 1561712.4本論文的研究?jī)?nèi)容及研究意義 1515293第三章實(shí)驗(yàn)部分 1652863.1材料與設(shè)備 16216753.1.1原材料 16127463.1.2主要儀器 1627083.1.3主要試劑 1663253.2林蛙皮中提取膠原蛋白試驗(yàn)方法 17107553.2.1膠原蛋白的提取工藝方法 17295573.2.2對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定林蛙皮中膠原蛋白的含量 17198993.3結(jié)論與討論 19202293.3.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 19161343.3.2膠原蛋白提取的試驗(yàn)結(jié)果比較與討論 20263293.4最佳提取方法的工藝優(yōu)化 21198543.4.1酸法提取溶劑的選擇 21281153.4.2單因素試驗(yàn) 227793.4.3正交試驗(yàn) 2518365第四章結(jié)論與展望 27310464.1結(jié)論 27327054.2展望 273388致謝 2827511參考文獻(xiàn) 29長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文第一章前言中國(guó)林蛙（Ranachensinensis），是我國(guó)山區(qū)，尤其是東北山區(qū)，包括長(zhǎng)白山脈、小興安嶺大部、張廣才嶺腹地，純野生動(dòng)物，亦被稱(chēng)作哈什螞（哈士?。?。其與蛤蟆、田雞完全是非同原動(dòng)物。唯中國(guó)僅有，已被列為易危物種。是集藥用、食補(bǔ)和美容功能于一體的珍稀兩棲類(lèi)動(dòng)物[1]。中國(guó)林蛙憑借其特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值日益受到人們的重視，成為蛙類(lèi)中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種。在各地所產(chǎn)的林蛙中，以東北地區(qū)的林蛙體格大、產(chǎn)油率高、體制健壯、繁殖率高而成為林蛙中的極品。中國(guó)林蛙富含18種氨基酸、4種激素、13種微量元素和9種維生素[2]，在藥用、滋補(bǔ)和美容方面都具有非常高的利用價(jià)值。林蛙的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高，俗稱(chēng)“大補(bǔ)品”。由于其主要以昆蟲(chóng)類(lèi)為食，因此又稱(chēng)“農(nóng)林衛(wèi)士”和“純綠色食品”，在近些年市場(chǎng)上顯現(xiàn)出了巨大的商機(jī)。中國(guó)林蛙皮中含有豐富的膠原蛋白資源。膠原蛋白富含除半胱氨酸和色氨酸外的18種氨基酸，其中有7種是維持人體生長(zhǎng)所必需的氨基酸，在膠原蛋白中甘氨酸占30％，而脯氨酸和羥脯氨酸含量共占約25％，是各類(lèi)蛋白質(zhì)中含量最高的，此外，丙氨酸和谷氨酸的含量也都比較高[2]，同時(shí)膠原蛋白還含括了一般蛋白質(zhì)中極少見(jiàn)的羥脯氨酸和焦谷氨酸以及在其他種類(lèi)蛋白質(zhì)中幾乎不存在的羥基賴(lài)氨酸。有資料報(bào)道：膠原蛋白肽可以被人體主動(dòng)且無(wú)障礙吸收[3]。由此可見(jiàn)，膠原蛋白具有十分豐富的營(yíng)養(yǎng)。本課題立足于中國(guó)林蛙資源豐富以及蛙皮中含有大量生物活性物質(zhì)這一優(yōu)勢(shì)[4]，以干燥的林蛙皮為原料，對(duì)從林蛙皮中提取膠原蛋白相關(guān)提取方法比較做重點(diǎn)研究。目前廣泛采用的提取膠原的方法主要分為酸法、堿法、酶法、鹽法以及熱水浸提法5類(lèi)。本課題以干燥的林蛙皮為原料,研究其膠原蛋白的酸法、堿法、酶法、鹽法及熱水法提取工藝條件,對(duì)比不同提取方法提取得到的膠原得率，比較出最佳的膠原提取方法，并通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)最佳的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，從而得出最佳的工藝條件。

第二章文獻(xiàn)綜述中國(guó)林蛙（Ranachensinensis），俗稱(chēng)哈什蟆，在分類(lèi)上屬于兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科、蛙屬[2]，主要分布在中國(guó)東北山區(qū)，包括長(zhǎng)白山脈、小興安嶺大部等地，是純野生動(dòng)物，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1]。中國(guó)林蛙與蛤蟆、田雞完全是非同原動(dòng)物。近年來(lái)由于過(guò)量捕獲，林蛙已被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》，為易危（v）物種[1]。中國(guó)林蛙是集藥用、食補(bǔ)和美容功能于一體的珍稀兩棲類(lèi)動(dòng)物。中國(guó)林蛙憑借其特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值日益受到人們的重視，成為蛙類(lèi)中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種。在各地所產(chǎn)的林蛙中，以東北地區(qū)的林蛙體格大、產(chǎn)油率高、體制健壯、繁殖率高而成為林蛙中的極品。中國(guó)林蛙富含18種氨基酸、4種激素、13種微量元素和9種維生素，在藥用、滋補(bǔ)和美容方面都具有非常高的利用價(jià)值[2]。林蛙的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高，俗稱(chēng)“大補(bǔ)品”。林蛙全身是寶：這其中林蛙皮是高級(jí)制革業(yè)的主要原材料；林蛙卵中富含卵磷脂和性激素；林蛙肉憑借其低脂肪、高蛋白的特性可加工成高級(jí)保健品[5]；林蛙雌蛙輸卵管的干燥物即林蛙油，又稱(chēng)哈什蟆油，是極其珍貴的藥材[6]。哈什蟆油是我國(guó)醫(yī)學(xué)中記載使用的滋補(bǔ)強(qiáng)壯之藥物，有補(bǔ)虛、增精、解毒、退熱、消腫、潤(rùn)肺、益肝腎、健脾胃之功效，可治療神經(jīng)衰弱、失眠眩暈、脾胃虛弱、體弱氣虛、咳嗽肺虛、創(chuàng)痛腫毒、水腫腹脹、肝炎和瘡疾、肺結(jié)核等疾病[2]。此外，提取到林蛙油后的副產(chǎn)品，如骨骼、內(nèi)臟、肌肉等也可作為毛皮動(dòng)物的飼料，又可浸泡后入藥。林蛙除了藥用、美容、保健、飼料價(jià)值外，在中國(guó)東三省和廣東、臺(tái)灣及東南亞等地又被人們充分的認(rèn)可，具有純天然的綠色的藥用和食用價(jià)值，因而，具有廣泛的消費(fèi)市場(chǎng)。中國(guó)林蛙中雌蛙體長(zhǎng)約為75mm左右，雄蛙體長(zhǎng)較??；林蛙的頭部很發(fā)達(dá)，位于身體的前端，背面觀呈三角形，扁而寬，頭長(zhǎng)路小于頭寬，頭長(zhǎng)與體長(zhǎng)相比較，為體長(zhǎng)0.32-0.38倍；林蛙的口寬闊，位于吻端腹面，吻尖，向前突妯，略長(zhǎng)于下頜，吻端上方有一對(duì)外鼻孔，其上有瓣膜，可隨時(shí)開(kāi)閉，以控制氣體進(jìn)出，頭兩側(cè)有大而凸出的眼，眼有上下眼瞼，下眼臉的上方有二層折疊的眼瞼，可以上下移動(dòng)遮著眼球以適應(yīng)陸地生活，兩眼后方各有一圓形鼓膜、遮著鼓室并傳導(dǎo)空氣中聲波產(chǎn)生所覺(jué)；雄蛙在鼓膜后的兩側(cè)各有一個(gè)聲囊；林蛙的軀干部自頸椎部起至體后端正中部分，即鼓膜之后為軀干部，是身體各部分中最大的一段，短而寬，軀體腹部較膨大，雌性比雄性大，沒(méi)有明顯的頸部，末端有二個(gè)泄殖腔孔，為泄殖腔的開(kāi)口；林蛙的前肢由上臂、前臂、腕、掌、四指組成，短而細(xì)，上臂部與手部長(zhǎng)度相比，上臂略短于手長(zhǎng)，指瑞無(wú)爪并鈍圓，關(guān)節(jié)下瘤、趾基下瘤及內(nèi)外掌突均明顯，指間無(wú)蹼，指長(zhǎng)順序?yàn)?、1、4、2；前肢背面有3-4條環(huán)形黑斑，雄蛙第一手指內(nèi)側(cè)有一瘤狀物為軟婚墊；林蛙的后肢發(fā)達(dá)，由股、脛、跗、五趾組成，其長(zhǎng)度為前肢的2.5-2.7倍，脛長(zhǎng)超過(guò)體長(zhǎng)之半，后肢拉直前伸，即脛跗關(guān)節(jié)前伸可超過(guò)眼部，伏臥時(shí)兩后肢的腳跟部常相互重疊，膝部?jī)?nèi)側(cè)有一明顯的突起；趾細(xì)而長(zhǎng)，具五趾，第1腳趾很短，第4趾特長(zhǎng)，為第1趾長(zhǎng)的4倍，趾長(zhǎng)順序?yàn)?、5、3、2、1，趾間有蹼，很發(fā)達(dá)，呈薄膜狀，蹼殊緣有淺凹，除第4恥外均達(dá)趾端，蹼膜寬順序?yàn)?-4、4-3、3-2、2-1，后肢肌肉發(fā)達(dá)；因此，林蛙善于跳躍、游缺、攀登、爬行。2.1林蛙皮2.1.1林蛙皮的功能中國(guó)林蛙皮在生命停止后，無(wú)論在水中泡或是烈日下曬，還是在陰干的地方存放，它的形體幾十年不會(huì)變質(zhì)、不會(huì)霉?fàn)€。冬季東北林蛙在河水凍成冰時(shí)，由于胸腹呼吸困難，因此可用皮膚進(jìn)行呼吸，夏季在進(jìn)入森林中，用皮膚從土地中、露水中吸水，其性格被堪稱(chēng)動(dòng)物中典范。(1)林蛙皮的保濕功能林蛙可以用皮膚呼吸并吸收水分，其機(jī)體具有完善的保濕系統(tǒng)，林蛙的某些組織中天然保濕因子含量較高，尤其是保濕因子的典型代表物透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)的含量與牛眼玻璃體中HA的含量接近，而牛眼玻璃體中HA的含量是至今為止動(dòng)物性原料中HA含量最高的。HA是目前世界公認(rèn)的性能優(yōu)越的保濕因子，其分子中的羧基和其他極性基團(tuán)可與水形成氫鍵而結(jié)合大量的水，當(dāng)含量低于0.1％時(shí)，HA可結(jié)合其質(zhì)量1000倍的水。這種天然保濕因子可使皮膚含水量增加，表皮角質(zhì)層柔軟，改善皮膚表面的血液循環(huán)，增強(qiáng)皮膚彈性，阻止表皮細(xì)胞纖維化，從而起到護(hù)膚作用。HA是皮膚固有的生物物質(zhì)，當(dāng)皮膚所含HA濃度下降時(shí)，可導(dǎo)致皮膚干燥和皺紋的產(chǎn)生，而通過(guò)口服或涂抹HA，可增加體內(nèi)HA及其合成前體，從而有效改善皮膚的保水性和彈性。HA可維持眼玻璃體呈膠凝狀，明顯延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間，是治療干眼病的首選藥物，還可應(yīng)用于眼科手術(shù)的粘彈性填充劑。HA在皮膚中可清除陽(yáng)光中的紫外線照射所產(chǎn)生的活性氧自由基，保護(hù)皮膚細(xì)胞免受其害，可有效抑制由于自由基侵害而出現(xiàn)的皮膚衰老及色素沉淀的出現(xiàn)，提高皮膚的抗病能力。人們以雄性林蛙皮及摘油后的雌性林蛙皮為原料，采用復(fù)合酶解進(jìn)行天然保濕因子的提取和純化，最終得到HA純品。HA目前的市售價(jià)格為雄性林蛙及摘油后的雌性林蛙胴體價(jià)格的11300倍以上，因此林蛙皮的利用為提高林蛙產(chǎn)品的附加值，實(shí)現(xiàn)其高附加值綜合利用開(kāi)辟了一條新途徑。(2)林蛙皮的治療痤瘡功能痤瘡俗稱(chēng)“青春痘”，是最常見(jiàn)的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病。中國(guó)醫(yī)學(xué)研究表明：痤瘡雖生長(zhǎng)在皮膚表面，但與臟腑功能失調(diào)息息相關(guān)；西醫(yī)認(rèn)為痤瘡與內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)，此外與神經(jīng)精神因素、飲食因素、大便睡眠等個(gè)人行為因素、煙酒等嗜好因素、藥物因素、化妝品及皮膚護(hù)理因素等誘因有關(guān)。研究表明，大孔多肽因子為蛙皮的有效成份且具有廣譜殺菌的功效，可有效的殺滅由皮膚表層引起的豆口、痤瘡而產(chǎn)生的細(xì)菌，在加上其保濕因子的作用，使皮膚表面溫度上升、表皮角質(zhì)層柔軟、血液的循環(huán)得到改善，進(jìn)而可以達(dá)到治療痤瘡、皮膚濕潤(rùn)祛斑的目的。(3)林蛙皮的祛斑功能斑是困擾人們的一種皮膚疾病。斑產(chǎn)生可能有遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、日曬衰老等多種原因。林蛙皮的透明質(zhì)酸HA在抗氧化試驗(yàn)中表現(xiàn)出了與谷胱甘肽等非酶自由基清除劑相同的作用，所以它具有對(duì)理想細(xì)胞的保護(hù)作用，可以延緩因?yàn)樽杂苫那趾Χ鸬纳爻林推つw衰老，并可以改善皮膚的新陳代謝，以此加速皮膚中黑色素的分解，達(dá)到提高皮膚抗病能力的作用，從而具有祛斑的功效。

(4)林蛙皮的祛皺功能研究結(jié)果表明，林蛙皮中膠原蛋白的含量可達(dá)48％，而多肽類(lèi)的含量可達(dá)10％以上。林蛙皮中的膠原蛋白，經(jīng)過(guò)口服吸收，可以有效的補(bǔ)充人體衰老的肌膚中流失的膠原蛋白，能提高皮膚彈性，并且能減少皺紋生成。此外，林蛙皮中保濕因子--透明質(zhì)酸HA可以有效提高皮膚中保濕因子的含量，增強(qiáng)皮膚的保水性，并能夠減少由紫外線照射而產(chǎn)生的自由基損害皮膚，可提高皮膚的抗病能力。綜合以上結(jié)果，膠原蛋白可以減輕皮膚的衰老癥狀，使皮膚逐漸恢復(fù)原有彈性。

林蛙皮中含有大量的多肽類(lèi)成分，可以防治自身受感染。它的皮腺內(nèi)包含各種活性因子，其包括多肽生長(zhǎng)因子、保濕因子、血管緊張素因子、林蛙生物抗菌因子、舒緩激肽樣多肽、鈴蟾肽類(lèi)因子、嗎啡因子、促甲狀腺素肽類(lèi)等14種多肽類(lèi)因子。研究表明，林蛙皮當(dāng)中抗菌多肽有廣譜抗菌作用，其包括對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌特別對(duì)耐藥株有明顯的抑制作用，還可殺滅皮膚當(dāng)中各種有害的細(xì)菌，有助于減少青春痘生成，并且以不損害真核細(xì)胞為前提對(duì)癌細(xì)胞、病毒和真菌有抑殺作用。亦可用來(lái)治療腸炎、痢疾、胃痛等某些炎癥類(lèi)的疾病。在世界范圍內(nèi)林蛙油保健效果已得到普遍的共識(shí)，林蛙皮當(dāng)中的活性成分同林蛙油類(lèi)似，即可促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)，亦可延緩組織細(xì)胞的衰老。當(dāng)代研究證明，林蛙皮的成分組成當(dāng)中含有不同種類(lèi)的活性因子，它的作用是由一種或幾種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用誘導(dǎo)細(xì)胞DNA的分裂和合成。林蛙皮當(dāng)中含有蛙皮素，含豐富的脯氨酸抗菌肽可以預(yù)防創(chuàng)面感染，它的特點(diǎn)是抗菌譜廣，并能在幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)殺死病原菌，且對(duì)正常細(xì)胞是沒(méi)有害的。林蛙的活性蛙皮在治療創(chuàng)傷的過(guò)程中，即有抗感染又有止痛、止血、透氣、保濕和隔絕創(chuàng)面的作用，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的敷料，一方面主動(dòng)參與，促進(jìn)創(chuàng)面愈合；同時(shí)，可以覆蓋創(chuàng)面，是一種新型的膠體生物敷料。成纖維細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)極為重要的一種細(xì)胞，在創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。隨著年齡的增長(zhǎng)人體內(nèi)透明質(zhì)酸HA的含量逐漸降低，極可能與老化時(shí)皮膚彈性的下降有關(guān)。林蛙皮當(dāng)中膠原蛋白的含量可達(dá)到48%，多肽類(lèi)得含量可達(dá)到10%以上，透明質(zhì)酸（HA）的含量極為豐富，這幾種成分則是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的基質(zhì)。人類(lèi)的皮膚內(nèi)透明質(zhì)酸HA伴隨著衰老，特別是光導(dǎo)致的老化，透明質(zhì)酸（HA）的含量會(huì)逐漸減少，同時(shí)皮膚的保濕能力也有所下降。在機(jī)體內(nèi)透明質(zhì)酸HA以它特有的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)成就了很多重要的生理功能。它具有特殊的持水作用，是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的在自然界中保濕性最佳的一種物質(zhì)，故被稱(chēng)為理想天然保濕因子（NMF)。人類(lèi)皮膚的成熟和老化過(guò)程亦隨著透明質(zhì)酸（HA）的新陳代謝和含量多少而變化，適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充透明質(zhì)酸（HA）可以改善皮膚的營(yíng)養(yǎng)代謝，從而使皮膚去皺、光滑、柔嫩、提高彈性、預(yù)防皮膚衰老。通過(guò)研究可知，林蛙皮的提取液能顯著提高成纖維細(xì)胞增殖，其中透明質(zhì)酸HA成分極可能起重要作用，從而進(jìn)一步證明林蛙皮可以促進(jìn)傷口愈合、恢復(fù)衰老皮膚的彈性以及治療燒傷等過(guò)程作用機(jī)制，成為林蛙皮應(yīng)用于臨床的理論根據(jù)。2.1.2林蛙皮中膠原蛋白林蛙皮中的膠原蛋白：膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，英文學(xué)名Collagen。在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。為生物科技產(chǎn)業(yè)最具關(guān)鍵性的原材料之一，也是需求量十分龐大的最佳生物醫(yī)藥材料。其應(yīng)用領(lǐng)域包括生物醫(yī)藥材料、化妝品、食品工業(yè)、研究用途等。林蛙皮中含有許多生物活性物質(zhì)，其中膠原蛋白就是其中之一，且含量十分豐富。近些年，關(guān)于林蛙皮中膠原蛋白提取和研究受到廣泛關(guān)注。膠原蛋白是一種高分子蛋白質(zhì)，絲狀的膠原蛋白纖維能使皮膚保持結(jié)實(shí)而有彈性。它存在于人體皮膚、骨骼、牙齒、肌腱等部位，主要生理機(jī)能是做結(jié)締組織的粘合物質(zhì)。在皮膚方面，它與彈力纖維合力構(gòu)成網(wǎng)狀支撐體，提供真皮層安定有力的支撐。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體膠原蛋白含量會(huì)逐漸流失，網(wǎng)狀支撐體亦會(huì)漸漸變厚變硬、失去彈性，當(dāng)真皮層的彈性與保水度降低，皮膚便會(huì)失去彈性并變薄老化，同時(shí)可導(dǎo)致真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少，使皮膚出現(xiàn)色斑、皺紋等一系列老化現(xiàn)象，顯出老態(tài)。膠原蛋白是人體皮膚的主要成分，占人類(lèi)皮膚干重70%-80%。醫(yī)學(xué)研究提示；膠原蛋白中的羥脯氨酸是人體皮膚形成的關(guān)鍵物質(zhì)。膠原蛋白在結(jié)締組織與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一定的機(jī)械強(qiáng)度，是承托人體曲線，體現(xiàn)挺拔體態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ)。膠原蛋白還能保持血管壁彈性，防止血管破裂，栓塞。提高關(guān)節(jié)、軟骨以及韌帶的潤(rùn)滑，減輕關(guān)節(jié)僵硬、酸痛、積水等癥狀。膠原蛋白（英文“collagen”）是一種天然存在的無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì)，主要存在于動(dòng)物的皮、骨、肌腱等組織中，是人體和脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用。膠原蛋白是體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白總量的25%-30%，相當(dāng)于體重的6%。近年來(lái)，隨著膠原蛋白提取技術(shù)的發(fā)展和結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等方面的深入研究，膠原蛋白水解產(chǎn)物和多肽的生物功能也逐漸得到了廣泛的認(rèn)同，膠原蛋白作為天然的生物資源具有優(yōu)越的生物相容性和生物可降解性，使其在食品、美容美體、醫(yī)療保健等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[7]。2.1.3林蛙皮研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景東北林蛙皮成份組成中含有活性因子,它是蛋白質(zhì)和肽類(lèi)，其作用是一種或幾種生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA的合成和分裂，其結(jié)構(gòu)與人體生物皮類(lèi)同。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)此已有所熟悉，如：血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮因子、酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、生物抗菌因子等，某些生長(zhǎng)因子也有趨化作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的血管形成因子?？煞乐箘?chuàng)面感染，其特點(diǎn)是抗菌譜廣，能在幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)殺死病原菌，而且對(duì)正常細(xì)胞是無(wú)害的。東北林蛙活性蛙皮在治療創(chuàng)傷中，即有隔絕創(chuàng)面又有止血、止痛、保濕、透氣、抗感染的作用，是不可多得的生物敷料?？纱?zhèn)鹘y(tǒng)敷料，它一方面可以覆蓋創(chuàng)面，同時(shí)，主動(dòng)參與和促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是一種新型膠體生物敷料。同時(shí)林蛙皮中含有豐富的透明質(zhì)酸，HA是一種高分子量的直鏈多糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸二糖單位重復(fù)交替連接形成。HA廣泛的分布于動(dòng)物和人體的結(jié)締組織中，但不同組織來(lái)源的HA化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同，只是在含量多少和相對(duì)分子量大小上存在差異，沒(méi)有種屬特異性。經(jīng)過(guò)多年的研究，人們對(duì)HA的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生理功能已有了明確的認(rèn)識(shí)。它在水溶液中的無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)和它的流體動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)賦予其重要的物理特性，即高度粘彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性，作為一種可吸收、可降解的生物材料，其應(yīng)用研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，表現(xiàn)出良好的市場(chǎng)前景。由于HA具有保濕功能，廣泛用于化妝品和口服美容保健食品中；作為粘彈性保護(hù)劑，用于眼科手術(shù)和關(guān)節(jié)疾病的治療；作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用；交聯(lián)的HA在粘連的預(yù)防和軟組織修復(fù)等應(yīng)用中獲得成功；HA與其他藥物反應(yīng)形成的加合物對(duì)藥物發(fā)揮控釋作用，可達(dá)到定向和定時(shí)釋放的目的。林蛙皮表面濕潤(rùn)、裸露，為抵御環(huán)境有害因子侵襲，在自然選擇的過(guò)程中，經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化，其皮膚分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物質(zhì)。此種物質(zhì)能抑制部分菌種的生長(zhǎng)，可以將其開(kāi)發(fā)為低毒、高效藥用資源或食物保鮮劑。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)中國(guó)林蛙的研究多見(jiàn)于雌性東北林蛙輸卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的報(bào)道，而對(duì)東北林蛙皮膚活性物質(zhì)的研究少有報(bào)導(dǎo)。蛙類(lèi)皮膚中含有豐富的具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜多樣的生物活性物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值及較大的開(kāi)發(fā)利用潛力。國(guó)外對(duì)蛙類(lèi)皮膚中的活性多肽的研究有40多年的歷史。從70年代開(kāi)始，就已大規(guī)模地從兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚及其分泌物中尋找具有藥用價(jià)值的生物活性物質(zhì)，已涉及到600多種蛙類(lèi)，從中提取出100多種活性肽，其中對(duì)部分蛙皮多肽抗生素的結(jié)構(gòu)、功能與性質(zhì)等方面,已做了深入研究。這些活性肽的結(jié)構(gòu)功能各不相同，其中抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，不但能夠抗細(xì)菌，而且能夠抗真菌、抗原蟲(chóng)、抗腫瘤、抗病毒，對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞卻只有很低的毒性。可在食品工業(yè)中作為天然防腐劑加以應(yīng)用。2.2膠原蛋白2.2.1膠原蛋白的結(jié)構(gòu)膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其分子在細(xì)胞外基質(zhì)中聚集為超分子結(jié)構(gòu)。分子量為300ku。膠原蛋白最普遍的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)。其由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型。3條左手螺旋鏈叉相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)閉膠原蛋白獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。 人體之所以能夠活動(dòng)自如，就是因?yàn)橛嘘P(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)，大部分的關(guān)節(jié)，不但是提供人體活動(dòng)之需，并經(jīng)由軟骨保護(hù)骨頭避免磨損，軟骨當(dāng)中有65%至80%是由水所組成，其它則有醣蛋白、膠原蛋白及軟骨細(xì)胞，這些提供了軟骨健康營(yíng)養(yǎng)及功能保護(hù)。事實(shí)上，軟骨本身是一多孔結(jié)構(gòu)，膠原蛋白是一條條細(xì)長(zhǎng)纖維形成的網(wǎng)套，醣蛋白則是具有彈性的球體，水分則填塞其中，這些組成都必須完整，才可使軟骨負(fù)荷重力，若膠原蛋白變少，會(huì)使醣蛋白與膠原蛋白的網(wǎng)套連接松弛，或是醣蛋白內(nèi)含物減少，會(huì)使醣蛋白不再具有彈性，都會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)受力時(shí)容易變加速磨損，隨著患者年齡增長(zhǎng)，造成這些材質(zhì)自然消失或者功能退化，就形成所謂的退化性關(guān)節(jié)炎。所以銀發(fā)族、更年期婦女、運(yùn)動(dòng)過(guò)度者、骨折者或關(guān)節(jié)容易酸痛者應(yīng)多補(bǔ)充富含膠原蛋白之食物。2.2.2膠原蛋白的功效膠原蛋白對(duì)皮膚的作用膠原蛋白是人體皮膚真皮層的主要組成部分，它具有將水分保留在真皮層的作用，并提供支持和保護(hù)，賦予皮膚彈性和強(qiáng)度。隨著年齡的增長(zhǎng)，肌膚中的膠原蛋白會(huì)慢慢代謝減少，此外紫外線通過(guò)表皮達(dá)到真皮層，促使膠原蛋白分解。皮膚中缺乏膠原蛋白，膠原纖維就會(huì)發(fā)生聯(lián)固化，使細(xì)胞間粘多糖減少，皮膚便會(huì)失去柔軟、彈性和光澤，同時(shí)真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少，皮膚會(huì)出現(xiàn)色斑、皺紋等一系列老化現(xiàn)象。膠原蛋白對(duì)骨骼的作用骨骼中膠原含量約占20%，約占骨中總蛋白含量的80%。膠原蛋白可使鈣質(zhì)與骨細(xì)胞相結(jié)合。鈣對(duì)于骨骼來(lái)說(shuō)非常重要，骨骼中鈣的流失直接導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，當(dāng)鈣流失時(shí)，若只增加鈣的攝取量是無(wú)法改善這種骨質(zhì)疏松現(xiàn)象的，因?yàn)殁}無(wú)法在骨中得到保存。這時(shí)想要保住骨本就必須先補(bǔ)充膠原蛋白。另外，膠原蛋白還能使骨骼與牙齒更堅(jiān)硬、有彈性。骨骼與肌肉的相互聯(lián)接也靠膠原蛋白，這里的膠原蛋白稱(chēng)為肌腱。骨與骨之間相連接的部分（如膝蓋和關(guān)節(jié)等軟骨組織）的主要成分也是膠原蛋白，它使得人在做運(yùn)動(dòng)時(shí)筋骨能夠保持柔軟且有彈性。在一般動(dòng)物的筋骨中，也含有許多膠原蛋白稱(chēng)為“骨膠原”。因此，可以從動(dòng)物的筋骨中抽取膠原用作醫(yī)藥及工業(yè)用途[8]。膠原蛋白對(duì)眼睛的作用膠原蛋白是眼角膜的主要成分蛋白質(zhì)，眼角膜中所含膠原纖維呈現(xiàn)規(guī)則排列，這種結(jié)構(gòu)不但可使讓光線透過(guò)，還可令眼角膜呈現(xiàn)透明。圓錐角膜是一種眼科疾病，其機(jī)械強(qiáng)度要比正常角膜低，有研究表明通過(guò)核黃素及UV-A照射后得到的交聯(lián)的角膜膠原能夠增加角膜基質(zhì)的硬度，阻止圓錐角膜的進(jìn)一步發(fā)展。目前，還出現(xiàn)了以膠原蛋白為材料制成的隱形眼睛，能提高眼睛的保水力。此外，人體主要的內(nèi)臟器官、組織中都含膠原蛋白，其最大的功能在于保護(hù)和強(qiáng)化臟器，但不同器官、組織中膠原含量不同[8]。抗氧化自由基可攻擊生命大分子物質(zhì)及細(xì)胞壁，造成機(jī)體的多種損傷和病變，加速機(jī)體的衰老。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的自由基將會(huì)產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢。自由基清除劑也稱(chēng)為抗氧化劑，可清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷。自由基在體內(nèi)增加時(shí)，可作用于機(jī)體細(xì)胞的生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等)，使大分子受損，從而引起疾病和衰老。自由基在生物體內(nèi)對(duì)氧化和衰老起巨大作用，有效地清除超氧化自由基對(duì)抗氧化和抗衰老有積極地作用。MendisE等人利用三種商品酶對(duì)Hoki(Johniusbelengerii)魚(yú)鱗水解，然后檢測(cè)產(chǎn)生的膠原多肽的自由基清除能力。結(jié)果證實(shí)，胰蛋白酶水解所得的膠原多肽具有最強(qiáng)的自由基清除能力。并分離出了具有最強(qiáng)自由基清除能力的一個(gè)肽段，其序列為His-Gly．Pro-Leu．Gly．Pro．Leu（797Da）。而且，這個(gè)肽段對(duì)亞油酸自氧化的抑制能力接近BHT。進(jìn)一步研究證實(shí)，該肽段可以提高人的肝細(xì)胞中抗氧化酶的水平。經(jīng)推測(cè)認(rèn)為，該肽段可能與維持細(xì)胞環(huán)境氧化還原的平衡有關(guān)[9]。董玉婷研究了鱈魚(yú)皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)不同分子量的鱈魚(yú)皮膠原多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子都具有清除活性，分子量越低，活性越高。在相同濃度下，各多肽組分對(duì)羥基自由基的清除活性較超氧陰離子自由基高[10]。Jing-longYang等人分析軍草魚(yú)皮中明膠水解產(chǎn)物的特性及其抗氧化活性，得到酶水解后的魚(yú)皮明膠水解物分子量范圍在700Da．6500Da之間。其分子量大多在700Da以下的水解產(chǎn)物抗氧化能力顯著提高[11]。減肥降血脂減肥需要分解脂肪(分解代謝)，而膠原蛋白能激活脂肪酶的活性，使這種分解代謝過(guò)程增加和延長(zhǎng)。汪靜慧等人研究水產(chǎn)膠原肽對(duì)小鼠營(yíng)養(yǎng)性肥胖的預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)膠原肽可以明顯減少小鼠因高脂飲食導(dǎo)致的體重增加，對(duì)小鼠營(yíng)養(yǎng)性肥胖的預(yù)防作用顯著，對(duì)肝腎無(wú)損害并能減輕有害物對(duì)肝細(xì)胞的損傷[12]。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的黃碧霞等曾對(duì)補(bǔ)充了氨察，發(fā)萎現(xiàn)可加速人體的血清譬白蛋白、喜自細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞的生成，有明顯的提高免疫功能與改善心肌能的作用，調(diào)節(jié)血膽固醇和甘油三酯的作用[13]。降血壓高血圧是對(duì)人類(lèi)健康危害極大的一種疾病，潛伏期長(zhǎng)。高血壓的早期階段，一般沒(méi)有明顯不適癥，直至發(fā)生臨床跡象——心臟病發(fā)作、腦血管破裂而導(dǎo)致死亡。據(jù)國(guó)家高血壓研究中心統(tǒng)計(jì)，我國(guó)高血壓患者己達(dá)1.2億人，發(fā)病率為l0.8％其危害僅次于腫瘤。因此，治療和防治高血壓病是當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的一個(gè)熱門(mén)課題。許多醫(yī)學(xué)研究和臨床觀察表明，高血壓的發(fā)病與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotenisinconvertingenzyme，ACE)密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究證明，膠原蛋白水解產(chǎn)物中的一些多肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性具有較強(qiáng)的抑制作用，具有良好的降壓效果。趙元暉從海地瓜水解膠原蛋白中提取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，得到的肽主要由Glu、Asp、Pro、Gly、Ala這5種氨基酸組成，分子量在410-950Da之間[14]。陳勝軍等人探討了酶水解羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白制備抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)的工藝條件，采用雙酶復(fù)合水解工藝所得水解產(chǎn)物的水解度為30.43％體外對(duì)ACE的抑制率達(dá)68.6％[15]。林琳研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)皮膠原蛋白多肽Mw<2000Da的組分，通過(guò)長(zhǎng)期預(yù)防給藥的試驗(yàn)表明，可以顯著的降低。腎血管性高血壓大鼠的動(dòng)脈血壓，并能顯著降低人鼠血漿中AngII的含量，具有較好的降壓效果，呈劑量依賴(lài)性，200μg/g劑量的降壓效果與卡托普利14μg/g相當(dāng)[16]。預(yù)防疾病和術(shù)后恢復(fù)膠原蛋白能夠活化細(xì)胞機(jī)能，有加速血紅蛋白和紅細(xì)胞生成的功能，改善循環(huán)，提高免疫力，抑制癌細(xì)胞，有利于防治冠心病、缺血性腦病。它是適于糖尿病、腎臟病等重癥患者攝取的優(yōu)質(zhì)高蛋白。此外，膠原蛋白可協(xié)助機(jī)體排出鋁元素，減少鋁在體內(nèi)聚積，可預(yù)防老年癡呆癥。林琳研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)皮膠原蛋白多肽對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，并且隨著多肽濃度的增加，作用增強(qiáng)。崔鳳霞對(duì)海參中膠原蛋白肽活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，海參膠原肽在48小時(shí)內(nèi)均能顯著促進(jìn)OX-LDL誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞內(nèi)MDA水平，顯著提高細(xì)胞內(nèi)NOS活性和NO釋放量，且其作用效果隨濃度的增大而增強(qiáng)[17]。徐彬等人對(duì)重型顱腦損傷術(shù)后病人采用富含膠原蛋白肽的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)臨床應(yīng)用，探討重型顱腦損傷圍手術(shù)期營(yíng)養(yǎng)治療的有效方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于顱腦損傷術(shù)后患者，富含膠原蛋白肽的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，有助于降低高代謝，降低感染率，增強(qiáng)免疫力，有助于病情恢復(fù)，其降低病死率的效果，優(yōu)于其他腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)[18]。其他功效水解膠原蛋白中含有大量的甘氨酸，不僅在人體內(nèi)參與合成膠原蛋白，而且還是大腦細(xì)胞中的一種中樞神經(jīng)抑制性傳遞，對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用，對(duì)焦慮癥、神經(jīng)衰弱等有良好的治療作用。研究表明，膠原蛋白還能夠減少減緩更年期婦女的更年期癥狀，減輕不適的感覺(jué)。膠原蛋白可以抑制胃酸和胃原酶分泌的作用，可減輕胃潰瘍患者的疼痛感，促進(jìn)胃潰瘍愈合。此外，膠原蛋白還能夠保護(hù)胃粘膜，其機(jī)理為：1．膠原蛋白可在胃內(nèi)形成保護(hù)膜從而減少胃粘膜的損傷；2．提高胃粘膜cGMP/cAMP值，促進(jìn)胃粘膜細(xì)胞增殖；3．緩沖胃酸對(duì)潰瘍面的刺激，同時(shí)可促進(jìn)血小板的凝聚而有止血作用，減輕各種因素對(duì)胃粘膜的直接損傷。膠原蛋白來(lái)源廣泛，比一般藥物廉價(jià)，而且是體內(nèi)主要蛋白成份之一，無(wú)毒副作用，適合開(kāi)發(fā)保護(hù)胃粘膜類(lèi)保健食品[19]。2.2.3膠原蛋白的應(yīng)用在食品方面的應(yīng)用膠原蛋白本身即可作為一種食品，食用膠原一般來(lái)源于動(dòng)物的肌腱、真皮及骨膠原，外觀通常為白色，味道清淡，口感柔和，易消化。但大多數(shù)情況下，膠原蛋白在食品中會(huì)被作為功能物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。（1）在功能保健食品中的應(yīng)用膠原蛋白可降低膽固醇和血甘油三酯，并可增加體內(nèi)缺乏的一些必需微量元素，從而使之維持在相對(duì)正常的范圍，是一種十分理想的減肥和降血脂食品。膠原蛋白還有加速紅細(xì)胞和血紅蛋白生成的功能，可改善循環(huán)，有助于防治冠心病及缺血性腦病。膠原還可以保持血管的正常功能，與預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化有十分密切的關(guān)系。膠原蛋白還可以包住癌細(xì)胞，抑制其增殖和轉(zhuǎn)移。因此，它是適于腎臟病、糖尿病等重癥患者攝取的優(yōu)質(zhì)高蛋白[20]。此外，膠原蛋白可以協(xié)助機(jī)體排出鋁元素，從而降低老年癡呆癥的發(fā)生。研究表明，膠原蛋白可以減少婦女疾病，減緩婦女更年期癥狀。膠原中的甘氨酸，不僅參與合成膠原蛋白，也是大腦中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于中樞神經(jīng)有鎮(zhèn)靜之作用。同時(shí)，它對(duì)焦慮癥及神經(jīng)衰弱等也有很好的治療作用[21]。此外，膠原蛋白食品還能抑制蛋白質(zhì)因胃酸作用而引起的凝聚，有助于食物的消化，同時(shí)也有抑制胃酸和胃原酶分泌的作用，可減輕胃潰瘍患者的疼痛感，以促進(jìn)胃潰瘍的愈合。（2）在食品添加劑中的應(yīng)用酒類(lèi)、飲料澄清劑魚(yú)膠是一種功能性魚(yú)蛋白，是由魚(yú)體組織的膠原蛋白制成的水產(chǎn)品，包括粗膠、明膠和魚(yú)漂膠。它是國(guó)際上已公認(rèn)的最高級(jí)的膠澄清劑。在啤酒、葡萄酒行業(yè)明膠和魚(yú)膠作為澄清、沉降劑獲得了非常好的效果，產(chǎn)品質(zhì)量非常的穩(wěn)定。在果酒的釀造過(guò)程中也起到乳化、增黏、澄清、穩(wěn)定等作用。在茶飲料生產(chǎn)中，明膠可用于防止因長(zhǎng)時(shí)間存放而變混濁，可以改善茶飲料的品質(zhì)。明膠可通過(guò)破壞膠原蛋白分子內(nèi)部的氫鍵，使其原有的緊密超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，形成結(jié)構(gòu)松散的小分子，加入肉制品中可改善結(jié)締組織嫩度，使之具有優(yōu)良的品質(zhì)，不僅增加了蛋白質(zhì)含量，且口感好又有營(yíng)養(yǎng)。明膠還可以作為冷凍食品的改良劑，用作增黏劑，增黏熔較低，極易溶于熱水中，具有入口即化的特點(diǎn)，常用作糧食膠凍及果凍等。在冰淇淋和雪糕等生產(chǎn)中加入適量的明膠，可防止冰晶形成粗粒，保持組織的細(xì)膩并降低溶化速度。此外，膠原蛋白還有很好的染色性，可根據(jù)制品的需要，用食用色素將其染成相似于肌肉組織的紅色，令消費(fèi)者更容易接受。膠原蛋白經(jīng)過(guò)再分解而形成的膠原多肽，擁有很好的生物功能性及較高的消化吸收性，可廣泛應(yīng)用于鮮牛奶、奶粉、酸奶及奶飲料等乳制品之中，起到抗乳清析出和乳化穩(wěn)定的功效。膠原多肽還可以添加到面包、糕點(diǎn)中用于延長(zhǎng)老化時(shí)間和增加體積及松軟度，也可以添加至糖果中，令軟糖果保持穩(wěn)定的形態(tài)，即使承受了較大的壓力也不變形。（3）在食品包裝材料中的應(yīng)用人造腸衣是以膠原蛋白為主制造的膠原腸衣，本身是營(yíng)養(yǎng)十分豐富的高蛋白物質(zhì)，熱處理過(guò)程中，膠原幾乎和肉食品的收縮率一致，其它可食用包裝材料并不現(xiàn)具有這種優(yōu)點(diǎn)。膠原本身具有固定化酶的功能，可改善食品尤其是腸類(lèi)制品的風(fēng)味與質(zhì)量。人造膠原腸衣具有透明度高、口感好、制作工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)前景十分樂(lè)觀。包裝膜膠原蛋白可用作果脯、蜜餞的內(nèi)包裝膜輔，加以甘油等添加劑，提高膜機(jī)械性能的同時(shí)，也是可食性的膠原。包裝膜通常具有良好的熱封性、抗張強(qiáng)度和較高的防氣、隔油、阻濕性等功效，可被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)食品保鮮。明膠作為涂層材料使食品表面有光澤。明膠可作為穩(wěn)定劑，有防止產(chǎn)品干縮、變形的作用。明膠也具有保鮮作用，明膠溶液可以在果蔬的表面形成皮膜，保證食品的天然風(fēng)味并延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。這些作用都已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。在化妝品方面的應(yīng)用目前在化妝品工業(yè)中，多種不同的蛋白質(zhì)被作為原材料，其目的是保護(hù)皮膚的結(jié)構(gòu)和改善其功能。膠原蛋白可作為化妝品原材料的有效性已經(jīng)被確定。膠原蛋白用于化妝品中的主要功效如下：營(yíng)養(yǎng)性可補(bǔ)充皮膚層所需要的養(yǎng)分，補(bǔ)充17種對(duì)人有益的氨基酸，令皮膚中膠原蛋白的活性增加，保持角質(zhì)層得水分及纖維結(jié)構(gòu)完整性，可改善皮膚細(xì)胞得生存環(huán)境，促進(jìn)皮膚組織新陳代謝，達(dá)到延緩衰老、滋潤(rùn)皮膚、消皺、養(yǎng)發(fā)、美容的目的。修復(fù)性膠原蛋白與周?chē)M織的親和性很好，故而使之具有獨(dú)特的修復(fù)組織的功能。膠原蛋白可以用于皮膚的缺損修復(fù)和組織的缺損修復(fù)，是很好的醫(yī)用美容材料。保濕性天然保濕因子是維持皮膚水分十分重要的物質(zhì)，水解膠原產(chǎn)品中所含的氨基酸與天然保濕因子的成分極其相近。此外，膠原分子外側(cè)有大量的親水基團(tuán)羧基、羥基等存在，這使得膠原分子極易和水分子形成氫鍵，因此，膠原蛋白及多肽擁有相當(dāng)好的保水、保濕性能。配伍性膠原蛋白可調(diào)節(jié)和穩(wěn)定pH值、穩(wěn)定泡沫、乳化膠體。同時(shí)其作為一種功能性成分，在化妝品中能起到減輕各種表面活性劑等刺激性物質(zhì)對(duì)毛發(fā)和皮膚的損害的作用。（5）親和性膠原蛋白對(duì)皮膚、頭發(fā)表面的蛋白分子有很好的親和力。膠原蛋白分子通過(guò)物理吸附與皮膚、頭發(fā)結(jié)合，這些分子可滲入皮膚表皮、頭發(fā)甚至皮質(zhì)層以達(dá)到營(yíng)養(yǎng)皮膚的功效。在其他品方面的應(yīng)用（1）在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用膠原蛋白擁有很強(qiáng)的生物活性與生物功能，可以參與細(xì)胞遷移、分化及增殖，使骨、腱、軟骨、皮膚具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。膠原蛋白的抗原性較弱的同時(shí)生物相容性較好，故可作為生物醫(yī)藥材料中的基礎(chǔ)材料。在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用一種新型飼料蛋白質(zhì)添加劑——水解膠原蛋白粉，可完全或部分替代進(jìn)口魚(yú)粉，用于混、配合飼料的生產(chǎn)，具有較好的飼喂效果和很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。在造紙工業(yè)中的應(yīng)用膠原蛋白在造紙工業(yè)中既可以作為原料，也可以作為輔助劑使用。作為原料，膠原纖維分子中含有大量的羥基、氨基、羧基，而在纖維素中也含有大量的羥基和少量羧基。正是因?yàn)檫@兩種天然的高分子中含有許多活性基團(tuán)及活性部位，可通過(guò)化學(xué)或者物理方法制成復(fù)合材料，應(yīng)用于制造書(shū)面革、壁紙、膜塑包裝材料、遮光紙、生活用紙、生物膠原包裝紙、農(nóng)副產(chǎn)品包裝材料、復(fù)合降解材料等。作為輔助劑，膠原蛋白在造紙工業(yè)中可以作為黏合劑、增強(qiáng)劑、絮凝劑和表面活性劑等可用于砂紙、砂布等的制造。此外，明膠是照相工業(yè)之中制造感光膠片的重要原材料。明膠具有很多優(yōu)良的性能，在膠片行業(yè)中發(fā)揮許多作用。迄今為止，還沒(méi)有無(wú)一種材料能夠完全取代明膠[20]。2.2.4膠原蛋白的發(fā)展趨勢(shì)人們逐漸認(rèn)識(shí)到膠原蛋白保健功能和護(hù)膚功能，尤其是水解膠原蛋白(多肽和寡肽)，具有美容護(hù)膚、防治骨質(zhì)疏松、降血圧、保護(hù)胃粘膜和抗氧化等多種生理活性功能，而且膠原蛋白還具備溶解性好等良好的加工特性以及易于人體吸收等優(yōu)點(diǎn)，具有極高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。此外，由于瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)及宗教信仰等原因，對(duì)水產(chǎn)品來(lái)源的膠原多肽的研究成為熱點(diǎn)，同時(shí)此類(lèi)膠原多肽具有易于溶解、低抗原性、低變性溫度、易于提取、成本低等特點(diǎn)，更有應(yīng)用價(jià)值。隨著我國(guó)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的水產(chǎn)廢棄物如魚(yú)皮、魚(yú)鱗等產(chǎn)生。如能從這些廢棄物中提取膠原蛋白加以利用，可促進(jìn)水產(chǎn)加工廢棄物的綜合利用，減少環(huán)境污染，獲得更安全的膠原蛋白，開(kāi)發(fā)出各種營(yíng)養(yǎng)健康食品、化妝品等高附加值的水解膠原系列產(chǎn)品。2.3膠原蛋白的提取方法迄今為止，膠原蛋白的提取方法依據(jù)提取介質(zhì)的不同可分為五類(lèi)，即酸法、堿法、酶法、鹽法以及熱水浸提法等[22]，其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。2.3.1酸法酸法是提取膠原比較常用和有效的方法，即是利用酸在一定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白，常用的酸有乙酸、鹽酸、檸檬酸和乳酸等。其原理是在低離子濃度酸性條件下破壞膠原纖維分子間的鹽鍵和Schiff堿，引起纖維膨脹、溶解，用酸法提取的膠原最大程度的保持了其3股螺旋結(jié)構(gòu)[23]。酸法的缺點(diǎn)是過(guò)于繁瑣且提取物不純，這就不利于食品、化妝品工業(yè)的加工采用[24]。2.3.2堿法堿法提取即利用堿在一定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白。堿法常用的處理劑為石灰、氫氧化鈉、碳酸鈉等。由于它容易造成肽鍵水解，因此得到的水解產(chǎn)物分子量比較低。所以，若想保留膠原的3股螺旋結(jié)構(gòu)，此法不可取。堿法存在環(huán)境污染，易使蛋白質(zhì)變性等缺點(diǎn)。迄今為止，有關(guān)用堿法提取膠原蛋白的報(bào)道相對(duì)較少，一般都是配合熱水法和酸法一起作用。2.3.3酶法酶法提取是利用蛋白酶使膠原溶解，水解條件溫和，反應(yīng)速率快，提取的膠原蛋白仍有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白純度高，理化性質(zhì)穩(wěn)定，且無(wú)環(huán)境污染。酶法提取常用的蛋白酶有：胃蛋白酶、胰蛋白酶或者復(fù)合酶[25]。由于具有速度快、純度高、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，酶提取法在試驗(yàn)中應(yīng)用較廣泛，但在酶水解下易有苦味肽的產(chǎn)生從而限制了其應(yīng)用范圍。2.3.4鹽法鹽法提取即利用各種不同的鹽在一定外界環(huán)境下提取鹽溶性膠原蛋白。鹽法提取膠原蛋白所用的中性鹽有鹽酸-三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化鈉、檸檬酸鹽等。在中性條件下，當(dāng)鹽的濃度達(dá)到一定量時(shí)，膠原溶解。并且可采用不同濃度的氯化鈉對(duì)提取的膠原蛋白進(jìn)行鹽析處理，可以沉淀出不同類(lèi)型的膠原蛋白。鹽法的缺陷是提取過(guò)程中可能降低膠原構(gòu)象的穩(wěn)定性。2.3.5熱水法熱水提取就是原料經(jīng)過(guò)各種前處理后在一定條件下用熱水浸提，從而得到水溶性膠原蛋白的方法。熱水提取法雖然沒(méi)有其他雜物的混入，但在高溫下蛋白質(zhì)容易變性，膠原的3股螺旋結(jié)構(gòu)得不到保留，這對(duì)提取產(chǎn)物影響頗大[26]。2.4本論文的研究?jī)?nèi)容及研究意義我國(guó)林蛙資源十分豐富，近年來(lái)關(guān)于中國(guó)林蛙的相關(guān)研究也越來(lái)越多，但人們過(guò)于粗放式的大量采集蛤士蟆油的同時(shí)，將林蛙其他的寶貴資源作為廢棄物丟棄十分可惜，既污染環(huán)境，又無(wú)法充分發(fā)揮林蛙的藥用和保健價(jià)值。林蛙皮是摘取林蛙油后作為飼料或廢棄物的物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，具有很高的綜合利用價(jià)值。本課題立足于中國(guó)林蛙資源豐富以及蛙皮中含有大量生物活性物質(zhì)這一優(yōu)勢(shì)，以干燥的林蛙皮為原料，對(duì)從林蛙皮中提取膠原蛋白相關(guān)提取方法比較進(jìn)行了研究，并對(duì)最佳的提取方法進(jìn)行了工藝優(yōu)化。從林蛙皮中提取膠原蛋白方法比較的研究必將拓寬中國(guó)林蛙開(kāi)發(fā)和利用的新途徑，不僅能豐富我國(guó)的藥用資源，還將為帶動(dòng)林蛙產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)貢獻(xiàn)和影響。

第三章實(shí)驗(yàn)部分3.1材料與設(shè)備3.1.1原材料林蛙皮：林蛙曬干，剝下林蛙皮；3.1.2主要儀器（1）TDZ5-WS型離心機(jī)，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；（2）GYB30-6D型高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；（3）HV-10電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；（4）UV1102型紫外分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器公司；（5）DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；（6）FD-1C型冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技有限公司；（7）DHG-914385-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；（8）RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；（9）KQ-250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；（10）HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；3.1.3主要試劑（1）濃鹽酸，分析純，北京試劑廠；（2）濃硫酸，分析純，北京試劑廠；（3）95%乙醇，分析純，北京試劑廠；（4）氫氧化鈉，分析純，北京試劑廠；（5）氯胺T，分析純，北京試劑廠；（6）檸檬酸，分析純，北京試劑廠；（7）碳酸鈉，分析純，北京試劑廠；（8）冰醋酸，分析純，北京試劑廠；（9）硝酸，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；（10）對(duì)苯二酚，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；（11）氫氧化鉀，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；（12）磷酸二氫鉀，分析純，北京試劑廠；（13）高氯酸，分析純，北京試劑廠；（14）對(duì)二甲氨基苯甲醛，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；（15）氯化亞錫，分析純，北京試劑廠；（16）醋酸鈉，分析純，北京試劑廠；（17）異丙醇，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；（18）正丙醇，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；3.2林蛙皮中提取膠原蛋白試驗(yàn)方法3.2.1膠原蛋白的提取工藝方法本試驗(yàn)研究從林蛙皮中提取膠原蛋白的方法比較，可利用對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法對(duì)各種方法同體積浸提液中膠原含量進(jìn)行測(cè)定，由于羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，故可以根據(jù)羥脯氨酸比色結(jié)果確認(rèn)溶液中膠原蛋白含量以比較各種方法提取效果。（1）熱水法浸提膠原提取工藝10.00g林蛙皮清洗瀝干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗滌瀝干200mL蒸餾水在42℃下浸提48h濾掉蛙皮得浸提液（2）酸法浸提膠原提取工藝10.00g林蛙皮清洗瀝干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗滌瀝干200mL0.1mol/L檸檬酸溶液在37℃下浸提48h濾掉蛙皮得浸提液（3）堿法浸提膠原提取工藝10.00g林蛙皮清洗瀝干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗滌瀝干200mL0.5mol/LKOH溶液在37℃下浸提48h濾掉蛙皮得浸提液（4）酶法浸提膠原提取工藝10.00g林蛙皮清洗瀝干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗滌瀝干加30mg胃蛋白酶、200mL0.5mol/L檸檬酸溶液在37℃下浸提48h濾掉蛙皮得浸提液（5）鹽法浸提膠原提取工藝10.00g林蛙皮清洗瀝干50mL10％Na2CO3溶液浸泡2h洗滌瀝干200mL5％NaCl溶液在37℃下浸提48h濾掉蛙皮得浸提液3.2.2對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定林蛙皮中膠原蛋白的含量試劑配制（1）0.75％氯化亞錫溶液：將7.5g氯化亞錫溶于500mL水中，再加入500mL6mol/L濃HCl。（2）氯胺T試劑：溶解1.41g氯胺T于100mL如上的緩沖試劑中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。（3）對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑：稱(chēng)取10.0g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0mL高氯酸［60%(m/m)］，緩慢加入65.0mL異丙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用）。（4）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A，500μg/mL：準(zhǔn)確稱(chēng)取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，用少量水溶解于100mL容量瓶中，加入一滴3mol/L硫酸，定容至刻度。該溶液在4℃下能穩(wěn)定至少一個(gè)月。（5）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B，10μg/mL：吸取5mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A于250容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度。該溶液在4℃下能穩(wěn)定至少一個(gè)月。（6）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取2mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A及40mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度（現(xiàn)配現(xiàn)用）。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取具塞試管24支，三支一組編號(hào)從0至7（每組三支為平行樣），第0組作為對(duì)照組。從第0組至第7組每支試管依次加入羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL，再按順序加入3.5mL、3.0mL、2.5mL、2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL、0mL蒸餾水，再向所有具塞試管中加入2.0mL異丙醇及2.0mL氯胺T，搖勻后在室溫下放置20min，加入2.0mL顯色劑，搖勻后迅速將試管移至60℃的水浴鍋中，保溫20min，再用流動(dòng)的自來(lái)水冷卻試管至少3min，室溫下放置30min，最后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。膠原蛋白提取的含量測(cè)定按工藝流程取五種方法所得浸提液各50mL，置于250mL磨口燒瓶中，加入幾粒沸石后，分別向各個(gè)燒瓶中加入氯化亞錫溶液100mL，置于水浴鍋上加熱回流6h以上。將超過(guò)6h水浴加熱回流的浸提液用濾紙過(guò)濾后，用6mol/L熱的HCl（約10-20mL）沖洗燒瓶和濾紙，反復(fù)沖洗幾次，冷卻后加水定容至250mL容量瓶中。吸取20mL水解溶液于100mL燒瓶，用10mol/LNaOH調(diào)pH至8，過(guò)濾于250mL容量瓶，用水沖洗燒杯和濾紙，反復(fù)數(shù)次，加水定容，混勻備用。吸取上步驟樣液1.0mL于10mL具塞比色管中，加入1.5mL蒸餾水，2mL異丙醇，1mL氯胺T，搖勻后放置4min，加入2mL對(duì)二甲氨基苯甲醛，加塞混勻，放入60℃水浴加熱20min，用冷水沖洗冷卻至室溫，于560nm處測(cè)吸光度。根據(jù)上述步驟每種方法取平行試驗(yàn)3組，根據(jù)比色測(cè)定結(jié)果及羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算浸提液中羥脯氨酸含量，由于樣品中膠原蛋白含量在等量樣品且稀釋倍數(shù)相同的情況下與羥脯氨酸含量成正比，因此羥脯氨酸含量最高的一組即為膠原蛋白含量最高的一組，該提取方法即為最優(yōu)方法。（公式1）式中：W—樣品中膠原蛋白含量，mg/g；A—標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)的羥脯氨酸濃度，μg/mL；11.1—換算系數(shù)；m—稱(chēng)取樣品質(zhì)量。3.3結(jié)論與討論3.3.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表3-1標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白吸光度值試管編號(hào)01234567羥脯氨酸濃度（μg/mL）02468101214標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.51.01.52.02.53.03.5水（mL）3.53.02.52.01.51.00.50異丙醇（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0氧化劑（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0顯色劑（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.0吸光度值A(chǔ)1(558nm)00.0380.0660.0860.1220.1550.1870.220吸光度值A(chǔ)2(558nm)00.0330.0640.0920.1240.1570.1860.212吸光度值A(chǔ)3(558nm)00.0330.0690.0940.1360.1560.1810.213平均吸光度值A(chǔ)(558nm)00.0350.0660.0910.1250.1560.1850.215圖3-1是采用對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)羥脯氨酸標(biāo)品的不同含量通過(guò)紫外分光光度計(jì)可以得到不同的吸光度從而測(cè)定出膠原蛋白含量，該圖的測(cè)定方程為Y=0.0301x+0.0046，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9991，該方程相關(guān)系數(shù)較高，線性較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線較準(zhǔn)確，可以來(lái)測(cè)定膠原蛋白含量，且誤差相對(duì)較小。圖3-1對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線3.3.2膠原蛋白提取的試驗(yàn)結(jié)果比較與討論由于樣品中膠原蛋白含量在等量樣品且稀釋倍數(shù)相同的情況下與羥脯氨酸含量成正比，因此羥脯氨酸含量最高的一組即為膠原蛋白含量最高的一組，該方法即為最佳提取方法。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)五種方法浸提膠原膠原蛋白的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)分析表明在同樣提取條件下酸法提取羥脯氨酸含量最高，即酸法為從林蛙皮中提取膠原蛋白的最優(yōu)方法。表3-2五種方法所得浸提液中羥脯氨酸含量的測(cè)定提取方法樣品質(zhì)量（g）吸光度值(558nm)平均吸光度值羥脯氨酸含量(μg/mL)熱水法10.000.3720.3250.3760.35811.73酸法10.000.5220.5040.5540.52717.34堿法10.000.4020.5160.4240.44714.69酶法10.000.4730.4570.4480.45915.08鹽法10.000.1870.2840.2760.2498.123.4最佳提取方法的工藝優(yōu)化3.4.1酸法提取溶劑的選擇酸法提取溶劑的選擇方法分別以檸檬酸、鹽酸、冰醋酸作為酸法的浸提溶劑，對(duì)酸法的最佳提取溶劑進(jìn)行選擇。稱(chēng)取10g蛙皮3組于錐形瓶中，分別加入200mL0.1mol/L檸檬酸、200mL0.1mol/L鹽酸、200mL0.1mol/L冰醋酸，在37℃下浸提48h后去除蛙皮得浸提液，再分別取浸提液50mL，按對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)膠原蛋白方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值對(duì)酸法提取溶劑進(jìn)行選擇。酸法提取溶劑的結(jié)果比較與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3-2），選取檸檬酸、鹽酸、冰醋酸分別為提取劑，在相同條件下，用檸檬酸提取所得浸提液中羥脯氨酸含量最高，故本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸作為浸提溶劑。圖3-2提取溶劑對(duì)膠原提取的影響3.4.2單因素試驗(yàn)單因素試驗(yàn)方法按一定的液料比稱(chēng)量經(jīng)脫色處理后瀝干的林蛙皮和一定濃度的檸檬酸在一定溫度下浸提若干時(shí)間，浸提后將林蛙皮去除得浸提液。根據(jù)對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定膠原蛋白含量。取所得浸提液50mL，置于250mL磨口燒瓶中，加入幾粒沸石后，分別向各個(gè)燒瓶中加入氯化亞錫溶液100mL，置于水浴鍋上加熱回流6h以上。將超過(guò)6h水浴加熱回流的浸提液用濾紙過(guò)濾后，用6mol/L熱的HCl（約10-20mL即可）沖洗燒瓶和濾紙，反復(fù)沖洗幾次，冷卻后加水定容至250mL容量瓶中。吸取20mL水解溶液于100mL燒瓶，用10mol/LNaOH調(diào)pH至8，過(guò)濾于250mL容量瓶，用水沖洗燒杯和濾紙，反復(fù)數(shù)次，加水定容，混勻備用。吸取上步驟樣液1.0mL于10mL具塞比色管中，加入1.5mL蒸餾水，2mL異丙醇，1mL氯胺T，搖勻后放置4min，加入2mL對(duì)二甲氨基苯甲醛，加塞混勻，放入60℃水浴加熱20min，用冷水沖洗冷卻至室溫，于560nm處測(cè)吸光度。將吸光度值帶入羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得羥脯氨酸含量。所有實(shí)驗(yàn)均平行操作三次，結(jié)果取平均值。（1）液料比對(duì)膠原提取的影響按照上述的提取方法，稱(chēng)取林蛙皮10g置于錐形瓶中，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1稱(chēng)量0.1mol/L的檸檬酸加入錐形瓶中，并于37℃下浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分別取浸提液50mL，按對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)膠原蛋白方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值計(jì)算浸提液中羥脯氨酸含量，確定較適宜的液料比。（2）檸檬酸溶液濃度對(duì)膠原提取的影響按照上述的提取方法，稱(chēng)取林蛙皮10g置于錐形瓶中，分別取檸檬酸溶液濃度為0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L，以液料比20∶1稱(chēng)量檸檬酸200mL加入錐形瓶中，并于37℃下浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分別取浸提液50mL，按對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)膠原蛋白方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值計(jì)算浸提液中羥脯氨酸含量，確定較適宜的檸檬酸溶液濃度。（3）提取時(shí)間對(duì)膠原提取的影響按照上述的提取方法，稱(chēng)取林蛙皮10g置于錐形瓶中，以液料比20∶1稱(chēng)量檸檬酸200mL加入錐形瓶中，并于37℃下分別浸提24h、36h、48h、60h、72h后去除蛙皮得浸提液，再分別取浸提液50mL，按對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)膠原蛋白方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值計(jì)算浸提液中羥脯氨酸含量，確定較適宜的提取時(shí)間。（4）提取溫度對(duì)膠原提取的影響按照上述的提取方法，稱(chēng)取林蛙皮10g置于錐形瓶中，以液料比20∶1稱(chēng)量檸檬酸200mL加入錐形瓶中，并于12℃、25℃、32℃、37℃、40℃下分別浸提36h后去除蛙皮得浸提液，再分別取浸提液50mL，按對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)膠原蛋白方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值計(jì)算浸提液中羥脯氨酸含量，確定較適宜的提取溫度。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較與討論（1）液料比對(duì)膠原提取的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3-3），當(dāng)液料比超過(guò)20∶1時(shí)浸提液中羥脯氨酸含量在逐漸降低?？赡苁谴藭r(shí)檸檬酸溶液對(duì)膠原的溶解已經(jīng)趨于飽和，過(guò)多的檸檬酸用量不能有效增加提取率，反而因?yàn)闄幟仕嵊昧康脑龆嘟档土四z原蛋白在溶劑中的濃度，使浸提液羥脯氨酸含量有所下降。圖3-3液料比對(duì)膠原提取的影響（2）檸檬酸溶液濃度對(duì)膠原提取的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3-4），隨著檸檬酸溶液濃度的提高，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸升高，原因可能是隨著提取劑濃度的增加，膠原蛋白的溶解度增加；但當(dāng)檸檬酸濃度超過(guò)0.1mol/L時(shí)，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸降低，可能是此時(shí)檸檬酸溶液對(duì)膠原的溶解已經(jīng)趨于飽和，過(guò)高的檸檬酸濃度不能有效增加提取率，反而因?yàn)闄幟仕釢舛鹊脑龆嘟档土四z原蛋白在溶劑中的濃度，使浸提液羥脯氨酸含量有所下降。圖3-4檸檬酸濃度對(duì)膠原提取的影響（3）提取時(shí)間對(duì)膠原提取的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3-5），隨著浸提時(shí)間的增加，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸增加。但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)48h以后，浸提液出現(xiàn)變味酸敗，蛙皮上有部分被霉菌感染，因此60h及72h兩組試驗(yàn)均被直接否定。圖3-5提取時(shí)間對(duì)膠原提取的影響（4）提取溫度對(duì)膠原提取的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（如圖3-6），提取溫度對(duì)提取膠原有一定影響。在37℃之前，浸提液中羥脯氨酸含量隨溫度上升而增高，但當(dāng)溫度超過(guò)37℃時(shí)，羥脯氨酸含量反而下降，這可能與膠原蛋白的溶解度有關(guān)。可能是低溫時(shí)提高溫度使分子動(dòng)能增加，提高了溶質(zhì)擴(kuò)散的速率，導(dǎo)致膠原溶解度的增加；但當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，由于反應(yīng)是放熱反應(yīng)，溶解度隨溫度升高而減少。圖3-6提取溫度對(duì)膠原提取的影響3.4.3正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)方法在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取四個(gè)主要影響因素：液料比、檸檬酸濃度、提取時(shí)間、提取溫度，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3-3，以浸提液中羥脯氨酸含量為指標(biāo)，確定最佳提取工藝。表3-3正交試驗(yàn)表水平因素A液料比（mL/g）B提取時(shí)間（h）C檸檬酸濃度（mol/L）D提取溫度（℃）115240.132220360.237325480.440正交試驗(yàn)結(jié)果比較與討論在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上按表3-3進(jìn)行了正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表表3-4：表3-4正交試驗(yàn)結(jié)果表試驗(yàn)號(hào)因素羥脯氨酸含量（μg/mL）ABCD液料比（mL/g）提取時(shí)間（h）檸檬酸濃度（mol/L）提取溫度（℃）111114.882122214.84313337.054212311.43522314.596231217.44731328.75832139.90933215.13均值18.928.4410.744.86均值211.159.7810.4713.68均值37.929.886.809.46R3.231.443.948.81較優(yōu)水平A2B3C1D2逐次因數(shù)D>C>A>B經(jīng)數(shù)據(jù)分析可知，對(duì)提取率影響最大試驗(yàn)因素的是提取溫度，其次是檸檬酸濃度、液料比、提取時(shí)間。最佳的提取工藝為：檸檬酸濃度0.1mol/L，提取溫度37℃，提取時(shí)間48h，液料比為20:1。

第四章結(jié)論與展望4.1結(jié)論（1）本論文對(duì)從林蛙皮中膠原蛋白的提取方法進(jìn)行了比較，分別利用熱水法、酸法、堿法、酶法及鹽法對(duì)林蛙皮中膠原蛋白進(jìn)行了提取，通過(guò)使用等量林蛙皮，等量浸提液，并取等量部分浸提液利用對(duì)二甲氨基苯甲醛法對(duì)浸提液中膠原含量進(jìn)行了測(cè)定，經(jīng)試驗(yàn)表明酸法為最佳提取方法。（2）在得出酸法為最佳提取方法后，對(duì)試驗(yàn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)確定了酸法提取的最佳工藝條件：檸檬酸濃度0.1mol/L，提取溫度37℃，提取時(shí)間48h，液料比為20:1。4.2展望中國(guó)林蛙資源十分豐富，且尚有很多附加價(jià)值有待進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。林蛙皮是摘取林蛙油后作為飼料或廢棄物的物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，具有很高的綜合利用價(jià)值。充分利用林蛙皮資源，既可以保護(hù)環(huán)境，也可以有效發(fā)揮中國(guó)林蛙的藥用、保健價(jià)值。對(duì)從林蛙皮中提取膠原蛋白方法比較的研究必將拓寬中國(guó)林蛙開(kāi)發(fā)和利用的新途徑，不僅能豐富我國(guó)的藥用資源，還對(duì)帶動(dòng)林蛙及膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)有著重要的影響和意義。

致謝本文是在導(dǎo)師邱芳萍老師悉心指導(dǎo)和大力支持下完成的。在試驗(yàn)的過(guò)程中，邱老師以其嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度、實(shí)事求是的科研作風(fēng)深深地感染和激勵(lì)著我，她淵博的知識(shí)、開(kāi)闊的視野和敏銳的思維給了我深深的啟迪，讓我終生受用。邱老師不僅在學(xué)業(yè)上給我以精心指導(dǎo)，同時(shí)還在思想、生活上給我以無(wú)微不至的關(guān)懷，在此向邱老師致以誠(chéng)摯的謝意和崇高的敬意。其次，我要感謝王志兵老師在論文試驗(yàn)和撰寫(xiě)過(guò)程中的耐心指導(dǎo)，這期間王老師為本畢業(yè)設(shè)計(jì)提出了許多寶貴的意見(jiàn)和建議。王老師不僅是我們求學(xué)路上的良師，更是我們生活中的益友，在此對(duì)王老師四年來(lái)的幫助表示深深的感謝。再次，在整個(gè)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施過(guò)程中，我得到了王長(zhǎng)周學(xué)長(zhǎng)、季曉峰學(xué)長(zhǎng)、杜琳學(xué)姐、刑燕學(xué)姐和紀(jì)可學(xué)姐的無(wú)私幫助，還有與我一同完成論文的李兵、萬(wàn)茉、王天龍同學(xué)的關(guān)心和支持，使我得以順利完成論文。沒(méi)有他們的幫助和支持，我是沒(méi)有辦法順利完成我的學(xué)位論文的，愿同窗之間的友誼長(zhǎng)存。最后，向大學(xué)本科四年里對(duì)我有過(guò)幫助的所有老師和同學(xué)們表達(dá)最衷心的感謝！感謝所有老師對(duì)我的辛勤培養(yǎng)和幫助！感謝所有同學(xué)對(duì)我的關(guān)心和支持！是你們讓我的大學(xué)生活充滿(mǎn)陽(yáng)光與溫暖，讓我人生的記憶中多了如此幸福的一筆。祝各位老師身體健康，工作順利，科研事業(yè)上取得更大的成就，祝各位同學(xué)能夠通過(guò)努力的奮斗實(shí)現(xiàn)自己的理想。謝謝！

參考文獻(xiàn)[1]李東風(fēng)，陳偉庭.中國(guó)林蛙研究進(jìn)展[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，28（1）：92～94.[2]胡曉丹，李波.哈士蟆的價(jià)值及利用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2001（2）：27～28.[3]葛蕾，李志西，司翔宇，等.超聲波提取蘋(píng)果渣多酚工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26（1）：79～81.[4]王長(zhǎng)周，邱芳萍，房天琪，等.林蛙皮膠原蛋白肽的制備工藝[J].食品工業(yè)科技，2012，33（7）：309～311.[5]崔巖，蔣超，崔春月.中國(guó)林蛙產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及利用現(xiàn)狀[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2006（12）：33.[6]李妍妍，鄭衛(wèi)星，王日昕，等.林蛙營(yíng)養(yǎng)成分的多元分析[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：472～-476.[7]蔣挺大，張春萍.膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：1～60.[8]萬(wàn)春燕，王英華，鄔元娟，等.膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景[J].中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng)，2008（9）：24～26.[9]MendisE，RajapakseN，KimSK．Antioxidantprop