體外受精與核移植動物優(yōu)秀課件

體外受精與核移植動物第1頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精與核移植動物第2頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.1胚胎工程胚胎工程（embryotechnology)是指對動物早期胚胎或配子進(jìn)行工程操作，獲得所需要的成體動物的技術(shù)。胚胎工程技術(shù)主要包括體外受精、胚胎移植、胚胎分割與融合、胚胎與精子、卵子冷凍、保存、胚胎性別控制、胚胎細(xì)胞核移植、基因?qū)氲?。?頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.2體外受精動物體外受精動物的概念體外受精動物的意義體外受精動物的培育程序第4頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精技術(shù)的發(fā)展20世紀(jì)60年代初至20世紀(jì)80年代中期，人們以家兔、小鼠和大鼠等為實驗材料，進(jìn)行了大量基因注射顯微操作圖。基礎(chǔ)研究，在精子獲能機(jī)理和獲能方法方面取得很大進(jìn)展。第5頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

這些理論和方法上的成就，推動了體外受精技術(shù)的發(fā)展，試管小鼠（Whit-tingham，1968）、大鼠（Toyoda和Chang，1974）、嬰兒（Steptoe和Edwards，1978）、牛(Brackett等，1982）、山羊(Hamda，1985）、綿羊(Hanada，1985）和豬(Chang等，1986）等相繼出生。第6頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精動物的概念：

體外受精（invitrofertilization,IVF）是指將哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。體外受精動物也稱試管動物（test-tubeanimal)是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動物。第7頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精動物的意義：發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力促進(jìn)家畜改良的速度保存遺傳資源輔助技術(shù)第8頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精動物培育的程序精子采集與體外獲能卵子采集與成熟培養(yǎng)體外受精重組胚激活與體外培養(yǎng)胚胎移植體內(nèi)發(fā)育、出生第9頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月精子采集與體外獲能1.采集精子并選擇有活力的精子上浮分離法：在精液中加入少量培養(yǎng)液，有活力的精子會游到培養(yǎng)液上部。這樣收集培養(yǎng)液上面的精子即可得到有活力的精子。2.精子獲能是指精子獲得穿透卵子透明帶能力的過程。目前可以采用添加誘導(dǎo)精子獲能物質(zhì)（如鈣離子、血清蛋白、肝素）的特定培養(yǎng)液來完成精子體外獲能。

第10頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月卵細(xì)胞回收與成熟培養(yǎng)卵細(xì)胞的回收（1）超數(shù)排卵（2）從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞（3）從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞第11頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）超數(shù)排卵

對于實驗動物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等采用的主要方法是；用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中，由于操作程序復(fù)雜，成本較高，很少使用。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵子進(jìn)入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時間，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。第12頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞

這種方法是借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。在家畜中，牛和馬等大家畜常用超聲波探測儀輔助取卵，其方法是用手從直腸把握卵巢，經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針，借助B型超聲波圖像引導(dǎo)，吸取大卵泡中的卵母細(xì)胞。按照目前的技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。在家畜中，活體采集的卵母細(xì)胞一般要經(jīng)成熟培養(yǎng)后才能與精子受精。這種方法對擴(kuò)繁優(yōu)良母畜具有重大意義，在有些國家已用于商業(yè)化生產(chǎn)。第13頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞

這種方法是從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃~37℃）后，快速運到實驗室，在無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細(xì)胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對卵巢進(jìn)行切片，收集卵母細(xì)胞。用此方法獲得的卵母細(xì)胞多數(shù)處于生發(fā)泡期（GV期），需要在體外培養(yǎng)成熟后才能與精子受精。從廢棄卵巢中采集卵母細(xì)胞的關(guān)鍵是注意卵巢的保溫和防止細(xì)菌污染。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液（PBS）的保溫瓶中；吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌；所用溶液都要添加抗生素。這種方法的最大優(yōu)點是材料來源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難。

第14頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

第15頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月母細(xì)胞的選擇

采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulusoocytecomplesxCOC）。無論采用何種方法，采集的COC都要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細(xì)胞分為A、B、C和D四個等級。A級卵母細(xì)胞要求有三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍，細(xì)胞質(zhì)均勻；B級要求卵母細(xì)胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞層低于三層或部分包圍卵母細(xì)胞；C級為沒有卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞；D級是死亡或退化的卵母細(xì)胞。在體外受精實踐中，一般只培養(yǎng)A級和B級卵母細(xì)胞。第16頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

第17頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)

由超數(shù)排卵采集的卵母細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，不需培養(yǎng)可直接與精子受精，對未成熟卵母細(xì)胞需要在體外培養(yǎng)成熟。培養(yǎng)時，先將采集的卵母細(xì)胞在實體顯微鏡經(jīng)過挑選和洗滌后，然后放入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)。通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細(xì)胞數(shù)按每5微升一個計算單位。卵母細(xì)胞移入小滴后，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養(yǎng)時間為20-24小時，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)成熟培養(yǎng)后，卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散靠近卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞呈放射狀排列，出現(xiàn)放射冠，用DNA特意性染料染色后，在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察，可見卵母細(xì)胞處于第2次成熟分裂中期。第18頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞成熟的一些標(biāo)志

生發(fā)泡破裂、染色體凝集、紡錘體形成、極體排出、透明帶軟化、卵丘細(xì)胞擴(kuò)散等。用DNA特異性染料染色后在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察，可見卵母細(xì)胞處于第二次成熟分裂中期。第19頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體外受精一共培養(yǎng)體外受精受精卵是否可以發(fā)育至囊胚是受精成功的標(biāo)志第21頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二顯微受精技術(shù)（輔助受精技術(shù)）輔助受精技術(shù)（Techniquesf.rassistedfertilizati.n）是IVF的延伸，它是通過人為方法使精子和卵子完成受精過程，克服在某些情況下精子不能穿過透明帶和卵黃膜的缺陷。這項技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代，20世紀(jì)80年代得到迅速發(fā)展，在醫(yī)學(xué)上已成為治療某些男性不育癥的主要措施之一；在基礎(chǔ)生物學(xué)中，它對研究哺乳動物受精和發(fā)育機(jī)理有很重要的價值；它還對挽救瀕危動物和充分利用優(yōu)良種公畜等有重要意義。目前哺乳動物的輔助受精技術(shù)有透明帶修飾和精子注人兩種方法。由于兩種方法都需要借助顯微操作儀來完成，所以又稱輔助受精技術(shù)為顯微授精（microinsemination）。第22頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月輔助受精兩種方法透明帶修飾法

精子注入法第23頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月透明帶修飾法

它是運用物理或化學(xué)方法對卵母細(xì)胞的透明帶進(jìn)行打孔、部分切除或撕開缺口，為精子進(jìn)入卵黃周隙打開通道，然后把卵子與一定濃度的精子共培養(yǎng)以完成受精過程.這種方法適用于具有一定運動能力，但頂體反應(yīng)不全，無法穿過透明帶的精子。它的優(yōu)點是對卵子的損傷小，但對于靠透明帶反應(yīng)阻止多精入卵的動物易造成多精子受精，影響胚胎繼續(xù)發(fā)育。目前這種方法僅在小鼠中取得成功。

第24頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月精子注入法

它是利用顯微操作儀直接把精子注入卵黃周隙或卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，前者稱透明帶下授精（subzonalinseminatiomSUZI），后者稱胞質(zhì)內(nèi)精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）。透明帶下授精對注入的精子數(shù)有嚴(yán)格要求：具有活力且已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子要單個注入；沒有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，注入的數(shù)目可加大。SUZI的優(yōu)點是對卵母細(xì)胞的損傷小，已在臨床醫(yī)學(xué)上得到運用，但多精入卵是制約這一技術(shù)發(fā)展的主要原因。胞質(zhì)內(nèi)精子注射對精子活力、形態(tài)和頂體反應(yīng)沒有特殊要求，只需注入單個精子即可，為提高受精率，注射后卵子需要人為激活。第25頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎培養(yǎng)受精卵在體外培養(yǎng)發(fā)育至桑葚期或囊胚期才能進(jìn)行移植。通常情況下，移植的較佳時期是發(fā)育至8～16細(xì)胞期的胚胎。發(fā)育阻滯：是指體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育中往往會停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯。提高受精卵發(fā)育率的關(guān)鍵因素：是選擇理想的培養(yǎng)體系。在家畜中，胚胎培養(yǎng)液分為復(fù)雜的和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液兩大類。復(fù)雜培養(yǎng)液中的成分很多，除無機(jī)和有機(jī)鹽外，還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營養(yǎng)成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它們培養(yǎng)胚胎時，可以采用體細(xì)胞共培養(yǎng)體系，即體細(xì)胞與胚胎在微滴中共同培養(yǎng)，利用體細(xì)胞生長過程中分泌的有益因子，促進(jìn)胚胎發(fā)育，克服發(fā)育阻斷。第26頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎移植

胚胎移植（embryotransfer,ET）是指將發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜卵管或子宮的技術(shù)。胚胎移植應(yīng)選擇與供體發(fā)情周期同步、生殖道正常、無疾病、繁育史良好的受體。通常采用藥物調(diào)控發(fā)情期的方法，來刺激或抑制動物的生理周期，從而達(dá)到動物發(fā)情的同步化。第27頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎移植的方法手術(shù)法適用對象：綿羊等小家畜一般采用手術(shù)法移植操作過程：將同期發(fā)情的受體動物仰面固定在手術(shù)床上，全身麻醉，借助內(nèi)窺鏡觀察排卵和黃體發(fā)育情況。腹部切口，將一側(cè)卵巢上有黃體發(fā)育的子宮遠(yuǎn)端拉出，吧胚胎輸入子宮上1／3處。也可先用鈍形針頭在要移植部位刺一個小孔，然后吧吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心將胚胎輸入。第28頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非手術(shù)法

使用對象：對于牛、馬等大家畜經(jīng)常采用非手術(shù)法。操作方法：一般使用專用胚胎槍直接插入子宮內(nèi)注入胚胎。第29頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.3試管嬰兒試管嬰兒：（test－tubebaby）是指卵子與精子在體外受精，培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，再植回受體子宮內(nèi)發(fā)育出生的嬰兒。1978年，世界首例試管嬰兒在英國誕生。1983年，澳大利亞培育出第一例人類冷凍胚胎試管嬰兒。1988年，我國首例常規(guī)試管嬰兒在北京醫(yī)科大學(xué)誕生。2000年，我國首例超快速冷凍胚胎移植的試管嬰兒在湖南醫(yī)科大學(xué)誕生。第30頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二、試管嬰兒

世界上第1例試管嬰兒LouisBrown在英國誕生第31頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月中國雙胞胎試管嬰兒第32頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月試管嬰兒可分為三個類型：第一代試管嬰兒：

1977年，愛德華茲（Edwards）和斯蒂普特（Steptoe)培育為第一代試管嬰兒。第33頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第二代試管嬰兒：1992年，Palermo的單精子卵細(xì)胞漿內(nèi)注射（ICSI）是第二代試管嬰兒通過先進(jìn)的顯微注射儀將單個精子注射進(jìn)卵子內(nèi)受精培育的嬰兒，因此這種方法又稱為顯微受精第二代試管嬰兒的技術(shù)關(guān)鍵在于顯微操作系統(tǒng)與注射技術(shù)的建立等第34頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第三代試管嬰兒：通過種植前遺傳學(xué)診斷（PDG）技術(shù)培育出的試管嬰兒將被稱為第三代試管嬰兒從體外受精的胚胎取出部分細(xì)胞進(jìn)行基因診斷，排出帶致病基因的胚胎后再進(jìn)行移植，從而實行胚胎著床前即診斷出遺傳病癥的愿望1990年，世界首例PDG試管嬰兒成功培育第35頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第四代試管嬰兒：借助別人卵漿增強(qiáng)自己卵子能力特征：卵漿置換只要針對那些卵子質(zhì)量不高、活力差的高齡女性第36頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月試管嬰兒（第一代）技術(shù)步驟女方超排卵與取卵精子采集與體外獲能處理體外受精受精卵體外培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植（選擇8細(xì)胞胚胎）與觀察子宮內(nèi)發(fā)育、嬰兒誕生第37頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.4核移植動物核移植：（cellnucleartransfer）是利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。細(xì)胞核移植動物：又稱為克隆動物（clonedanimal），是指用特定發(fā)育階段的核供體及相應(yīng)的核受體（去核的成熟卵細(xì)胞）體外構(gòu)建重組胚，通過胚胎移植到受體完成發(fā)育出生的動物。細(xì)胞核移植動物又稱為核質(zhì)雜種，包括胚胎細(xì)胞克隆動物和體細(xì)胞克隆動物。第38頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.4.1核移植動物培育流程：1.核供體細(xì)胞獲得與取核供體核細(xì)胞可以使原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞，從來源上包括胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞。分離制備單個動物細(xì)胞，通常采用處于G0期細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞。

第39頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴胚細(xì)胞用0.2%鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎，溶去胚胎的膠膜及透明帶，分離出單個卵裂球。消化透明帶的時間是影響卵裂球質(zhì)量的重要因素，作用時間短，透明帶不能充分消化，卵裂球不易獲得；作用時間長，則影響到卵質(zhì)膜，容易破裂，在操作時容易失敗。因此，在分離卵裂球時應(yīng)在解剖鏡下監(jiān)視透明帶的消化過程，當(dāng)透明帶變薄，膨脹適度時就應(yīng)移出，再用適當(dāng)口徑的吸管吹打使之分離。另外，蘇格蘭學(xué)者Campbell等顯微分離胚盤細(xì)胞并在體外進(jìn)行缺血饑餓傳代培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)，以便調(diào)整染色體結(jié)構(gòu)，從而有助于核的重組與發(fā)育，他們使用這種方法建立了綿羊TNT4細(xì)胞系，該細(xì)胞形態(tài)類似于胚胎干細(xì)胞，但更扁平、上皮化。第40頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

⑵體細(xì)胞

最早用青蛙腸粘膜上皮細(xì)胞獲得了后代。Wilmut等用綿羊乳腺細(xì)胞獲得Dolly羊。美國夏威夷大學(xué)RyuzoYanagimachi教授領(lǐng)導(dǎo)的一個國際科研小組于1998年以小鼠卵丘細(xì)胞為核供體，采用吸移管注入，利用機(jī)械和化學(xué)激活方式進(jìn)行細(xì)胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。對小鼠、牛體細(xì)胞移植的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)休眠（G0）的顆粒細(xì)胞核與去核MⅡ期卵母細(xì)胞構(gòu)成的體細(xì)胞重構(gòu)胚，其發(fā)育率及產(chǎn)生克隆后代的能力遠(yuǎn)高于其它類型的休眠體細(xì)胞，這可能緣于顆粒細(xì)胞上存在著與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系的胞質(zhì)微絨毛橋的緣故，它或許有助于供體核同受體核胞質(zhì)因子的交換。第41頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞核移植所用受體細(xì)胞一般采用MⅡ期成熟卵細(xì)胞，可以從動物體內(nèi)直接獲得，但數(shù)量有限。目前，高質(zhì)量的體外成熟（IVM）培養(yǎng)的卵細(xì)胞可以替代體內(nèi)成熟卵細(xì)胞進(jìn)行核移植。

2.受體細(xì)胞去核第42頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月受體細(xì)胞去核方法：⑴盲吸去核法：

用細(xì)胞骨架抑制劑——細(xì)胞松弛素B或秋水仙處理卵細(xì)胞，使細(xì)胞骨架松弛。用固定管在第二極體對面吸引固定卵細(xì)胞，將外徑25~30um的尖頭管輕輕刺入透明帶，停在第二極體附近的卵周隙中，輕輕將去核管連同其中的內(nèi)容物拉出透明帶，完成卵細(xì)胞去核。隨后將去核管內(nèi)的核驅(qū)出。去核后的卵細(xì)胞用培養(yǎng)液洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)1~2h，用作細(xì)胞核移植受體。可以用熒光染料Hoechst33342對卵細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，在紫外觀察下去核可提高去核成功率。第43頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

⑵功能性去核法：

通過用紫外線或激光照射使染色體失活而達(dá)到去核目的。第44頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑶化學(xué)誘導(dǎo)去核：

用脫羧秋水仙堿處理激活的小鼠MⅡ期卵細(xì)胞使其排放弟二極體。由于脫羧秋水仙堿的作用，核染色質(zhì)沒有分開而全部進(jìn)入第二極體。這樣就可完成去核。這種方法可以在同一時間大量去核，同時還避免了人為操作的不穩(wěn)定性，這使哺乳動物克隆技術(shù)大為簡化。第45頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3.細(xì)胞核移植核移植方法：⑴直接注射法利用較細(xì)的注核針抽吸核供體細(xì)胞使核膜破裂，吸入供體核后，直接刺破受體卵質(zhì)膜，將核直接注入卵周隙，完成細(xì)胞核移植。然后逐漸減少固定吸管的負(fù)壓放開重組胚。第46頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵透明帶下注射法

用核針將供體卵裂球或細(xì)胞核直接移至去核卵細(xì)胞的卵周隙，使供體核進(jìn)入受體卵胞質(zhì)內(nèi)，形成重組胚。第47頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4.重組胚激活

激活的方法：⑴電激活對已融合重組胚或胞質(zhì)內(nèi)注射的重組胚給予電刺激，使重組胚充分激活。第48頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵化學(xué)激活

單獨使用化學(xué)激活劑可對重組胚激活?；瘜W(xué)激活使用的激活劑包括7%乙醇、離子霉素、鈣離子載體A23187等。第49頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月5.重組胚培養(yǎng)和移植

⑴體外培養(yǎng)：將重組胚在特定培養(yǎng)液中培養(yǎng)為桑葚或胚囊胚，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移入同種的同期發(fā)情的受體中繼續(xù)發(fā)育。培養(yǎng)48h檢查重組胚的卵裂率，并觀察檢查，記錄桑葚胚及囊胚發(fā)育率。第50頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵體內(nèi)培養(yǎng)：

將重組胚植入同種或異種動物的輸卵管中發(fā)育為桑葚或胚囊胚，然后進(jìn)行胚胎移植。第51頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.4.2胚胎細(xì)胞克隆動物第52頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.4.3體細(xì)胞克隆動物真正意義上的克隆

——歷程碑式的突破第53頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到一個剔除了細(xì)胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內(nèi)。科學(xué)家共培育277個胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降臨人世。直到1997年2月23日才公布于眾。第54頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月體細(xì)胞克隆的應(yīng)用與意義

1、檢驗動物細(xì)胞全能性2、加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護(hù)珍貴動物3、利用轉(zhuǎn)基因克隆動物進(jìn)行生物藥物的生產(chǎn)4、異種器官移植（結(jié)合特異基因的敲除）5、治療性克?。梢杂没颊弑救思?xì)胞培育出新組織）第55頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2001年8月7日，美國科學(xué)院關(guān)于克隆人問題的討論會上，三位表示要克隆人的科學(xué)家。左：意大利國際聯(lián)合研究所所長SeverinoAntinori中：克隆援助（Clonaid）公司老板BrigitteBoisselier右：美國肯塔基大學(xué)教授PanayiotisMichaelZavos他們克隆人的目的都是為了給不孕的夫婦培育后代?？茖W(xué)三狂人克隆三瘋子第56頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月思考：

現(xiàn)如今克隆已經(jīng)取得了很大的成就，那它的繼續(xù)發(fā)展將會給我們這個現(xiàn)存的社會會帶來什么影響？你是否可想過如果有一天你和你的復(fù)制人一起生活呢？

……

思考才回創(chuàng)造喲！第58頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13.5冷凍保存技術(shù)保證了人工受精、胚胎移植等不受環(huán)境、地點和時間等因素的限制。為建立優(yōu)良動物的胚胎庫提供了可能。第59頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月15.5.1胚胎冷凍保存非冷凍保存：胚胎冷藏保存法：一般在0~4℃左右保存冷凍保存法：是指-196℃保存胚胎冷凍保存為建立優(yōu)良品種的胚胎庫提供了條件，同時也便于胚胎的運輸與移植。第60頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎冷凍保存抗凍保護(hù)劑的選擇⑴滲透型冷凍保護(hù)劑屬于細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑，一般為小分子物質(zhì)，在0℃以上很容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。常見的滲透型冷凍保護(hù)劑有甘油，二甲基亞砜，丙二醇和乙二醇。第61頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵非滲透型冷凍保護(hù)劑

屬于細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑，一般為大分子物質(zhì)，能夠溶解于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。常見的非滲透型冷凍保護(hù)劑包括單糖，二糖，三糖，聚乙烯吡咯烷酮等。第62頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎冷凍保存冷凍方法：（一）程序冷凍與復(fù)蘇

是目前胚胎冷凍最常用的方法之一。所用冷凍保護(hù)劑一般為二甲亞砜，氨基酸，丙三醇，1,2—丙二醇等影響因素包括：抗凍保護(hù)劑的選擇與濃度，植冰河降溫速度，解凍方法，抗凍劑的脫除等。第63頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

大致步驟如下：⑴將采集到的胚胎在含20％小牛血清的PBS溶液中洗滌2次。⑵將洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol／L甘油和20％小牛血清的PBS的冷凍液中平衡20min。⑶將胚胎和冷凍液裝入0.25mL胚胎冷凍細(xì)管中，封口，并在細(xì)管外標(biāo)記供體號，胚胎數(shù)量，等級，冷凍日期等。第64頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑷將裝入胚胎的細(xì)管放入冷凍儀中，在0℃平衡10min，以1℃／min的速度降至—7~—6℃，并在此溫度下誘發(fā)結(jié)晶，平衡10min,然后以0.3℃的速度降溫至—38~—35℃，投入液氮保存。⑸解凍時從冷凍液中取出裝胚胎的細(xì)管，在空氣中平衡10s，立即置于37℃水浴解凍，1min后取出完成解凍過程。⑹將細(xì)管中的冷凍液及配套推出，在顯微鏡下找到配套并移入解凍液。采用三步法解除甘油，每步5~7min，最后用PSB液將胚胎洗3~5遍，供移植備用。第65頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）玻璃化冷凍與復(fù)蘇

玻璃化冷凍法不需要專門儀器，假如高濃度的抗凍液急速冷凍，由液體轉(zhuǎn)化成透明膠狀固體。玻璃化冷凍保護(hù)液組成一般為：20.5