基因重組與定點(diǎn)突變

基因重組與定點(diǎn)突變第1頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月DNArecombination,

將不同來源的DNA片段通過末端共價(jià)連接形成重新組合的DNA分子的過程。Genecloning,在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的分離，剪切和重新連接，構(gòu)成重組的DNA分子，并在特定的受體細(xì)胞中，與載體一起得到復(fù)制和表達(dá)，從而獲得該分子的大量拷貝。第2頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

制備目的基因構(gòu)建重組體將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞重組體的篩選和鑒定重組體的擴(kuò)增和表達(dá)基因克隆的基本程序第4頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)定點(diǎn)突變寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變盒式突變或片段取代突變PCR定點(diǎn)突變隨機(jī)突變基因突變位點(diǎn)特異性突變第5頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)在體外特異性改變某個(gè)堿基的技術(shù)第6頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule.

第7頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月site-directedmutagenesistheresearcherscanstudyindetailhowproteinsfunctionandhowtheyinteractwithotherbiologicalmolecules.Site-directedmutagenesiscanbeused,forexample,tosystematicallychangeaminoacidsinenzymes,inordertobetterunderstandthefunctionoftheseimportantbiocatalysts.Theresearcherscanalsoanalysehowaproteinisfoldedintoitsbiologicallyactivethree-dimensionalstructure.Themethodcanalsobeusedtostudythecomplexcellularregulationofthegenesandtoincreaseourunderstandingofthemechanismbehindgeneticandinfectiousdiseases,includingcancer.第8頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

第9頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月1.影響的各種因素一.寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變1）DNA模板的制備2）引物的設(shè)計(jì)和選擇引物的特性引物的設(shè)計(jì)3）突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件4）關(guān)于DNA聚合酶的選擇5）受體細(xì)胞對(duì)突變體產(chǎn)率的影響第10頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法Kunkel突變法第11頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月1)將待突變的基因克隆到質(zhì)粒中，導(dǎo)入具有ung-dut-

雙缺陷的E.coli

中.dut-(缺少dUTPase，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升)細(xì)菌聚集dUTP，并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈。ung-(缺少尿嘧啶脫糖苷酶)細(xì)菌不能去除摻入的dUTP，最終的結(jié)果是，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA中，大約由1％的T被U所取代。第12頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Figure1.

dsDNAplasmidistransformedintoung-bacteriawhichconvertstheT's

toU's.Inthisexample,theGCbasepairwillbetargetedformutagenesis.

ThisU-containingplasmidisconvertedtosingle-strandedDNA.第13頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2)含有U的目標(biāo)DNA與含有突變的寡核苷酸片斷孵育，該寡核苷酸片斷除了需要的突變點(diǎn)外，都與目標(biāo)DNA配對(duì)。這種突變可以是一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的插入、刪除和堿基替換。然后該混合物與Klenow,dNTP‘s孵育，接著加入連接酶和ATP產(chǎn)生雙鏈的質(zhì)粒，其中一條鏈含有U，而新合成的鏈只含有T。需要注意的是突變的核苷酸與舊的模板鏈?zhǔn)遣慌鋵?duì)的。第14頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Figure2.Targetplasmidisusedasatemplatetoproduceasecondstrand

ofDNAthatcontainsthedesiredmutationandonlyT's第15頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3)最后，雜交的雙鏈DNA被轉(zhuǎn)入到正常的細(xì)菌中,其尿嘧啶－糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原來的模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。再以此突變鏈為模板合成出來的新鏈都含有突變堿基。最終所有的質(zhì)粒都含有新的突變堿基。第16頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Figure3.

Hybridplasmidistransformedintowild-typebacteriathatconverttheoriginalU-containingstrandofDNAintoastrandofT-containingDNAthatiscomplementofthemutatedsequence(ingreen).TheoriginalGC

basepairhasbeenconvertedtoanewTAbasepair.第17頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月抗生素抗性回復(fù)突變法此體系利用pALTER-1噬菌粒為突變載體。Thesystemsuseantibioticselectionasameanstoobtainahighfrequencyofmutants.

特點(diǎn)：1.有MCS2.含Amps,Tetr3.利用Helperphage第18頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

?previousPromegaCorporation~2800WoodsHollowRoad~Madison,WIUSA

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608-274-4330

printfigure0578va第19頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月pALTER?-1載體含氨芐青霉素和四環(huán)素兩個(gè)抗性基因,但是氨芐青霉素的抗性基因是沒有活性的。氨芐修復(fù)寡核甘酸可以在突變反應(yīng)中恢復(fù)突變鏈的氨芐的抗性。ThepALTER?-1Vectorcontainsgenesforampicillinandtetracyclineresistance,buttheampicillinresistancegenehasbeeninactivated.TheAmpicillinRepairOligonucleotiderestoresampicillinresistancetothemutantstrandduringthemutagenesisreaction.

第20頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)：多克隆位點(diǎn)，用以對(duì)目標(biāo)基因的克隆。含有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素(Amps)的抗性基因,在突變中用氨芐青霉素抗性修復(fù)寡核甘酸使AmpsAmpr,用于對(duì)陽性克隆的篩選。利用輔助噬菌體超感染，制備含目標(biāo)基因的單鏈DNA作為突變模板DNA。為提高突變效率，受體菌應(yīng)是點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)缺失的菌株。第21頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月適合的寡核甘酸片斷可以同時(shí)用在突變反應(yīng)中，去除一個(gè)抗生素活性的同時(shí)而修復(fù)另一種抗生素活性。用這種方法隨后的突變和選擇可以在同一質(zhì)粒上進(jìn)行，而不需要亞克隆。Theappropriateoligonucleotidescanbeusedsimultaneouslyinthemutagenesisreactiontoinactivateoneresistancegenewhilerepairingtheother.Inthisway,subsequentroundsofmutagenesisandselectioncanbeperformedonthesameplasmidwithoutsubcloning.

第26頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變法在突變載體DNA上除了有克隆外源基因的克隆位點(diǎn)外，還有一獨(dú)特的限制酶切位點(diǎn)。第27頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月該該位點(diǎn)也不存在目標(biāo)基因上第28頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月突變時(shí)用兩個(gè)引物：一是突變引物；二是獨(dú)特限制酶切位點(diǎn)去除的選擇性引物。第29頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：不需制備單鏈DNA;不需輔助噬菌體；不需進(jìn)行亞克隆。第30頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：方便、快捷、不受限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的限制二.利用PCR產(chǎn)生定點(diǎn)突變

利用PCR法在基因5’末端區(qū)或

3’末端區(qū)產(chǎn)生突變2.重疊延伸(overlapextension)和基因突變

第31頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5Add-onmutagenesis

Thisisacommonlyusedpracticeinwhichanewsequenceorchemicalgroupisaddedtothe5’endofaPCRproductbydesigningprimerswhichhavethedesiredspecificsequenceforthe3’partoftheprimerwhilethe5’partoftheprimercontainsthenovelsequenceorasequencewithanattachedchemicalgroup.Theextra5’sequencedoesnotparticipateinthefirstannealingstepofthePCRreaction(onlythe3’partoftheprimerisspecificforthetargetsequence),butitsubsequentlybecomesincorporatedintotheamplifiedproduct,therebygeneratingarecombinantproduct,第32頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月(A)5

add-onmutagenesis.Primerscanbemodifiedatthe5endtointroduce第33頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月加到PCR引物5‘端的序列摻入到PCR產(chǎn)物的末端。一個(gè)PCR擴(kuò)增片段可與另一個(gè)PCR擴(kuò)增片段上的序列相重疊，其后的反應(yīng)中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此產(chǎn)生一個(gè)新的重組分子。非生產(chǎn)鏈生產(chǎn)鏈第34頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月取代突變第35頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月缺失突變第36頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月插入突變第37頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月幾點(diǎn)補(bǔ)充：重疊延伸反應(yīng)中非生產(chǎn)鏈的命運(yùn)？重疊延伸反應(yīng)進(jìn)行基因剪接，其不同部位在反應(yīng)中執(zhí)行不同功能引導(dǎo)區(qū)(primingregion):寡核苷酸3’端重疊區(qū)(overlapregion):寡核苷酸5’端插入?yún)^(qū)：重疊區(qū)和引導(dǎo)區(qū)之間第39頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月盒式突變（cassettemutagenesis),

又稱片段取代法（DNAfragmentreplacement)關(guān)鍵1.目標(biāo)基因序列中有適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)

2.如何得到各種合適的用以取代目標(biāo)基因中特定DNA片段的突變DNA片段三.區(qū)域性定向突變第40頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月四.隨機(jī)突變（randommutagenesis)當(dāng)缺乏目的基因序列的詳盡資料時(shí)，定點(diǎn)突變就受到限制，此時(shí)可利用隨機(jī)突變。第41頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月待突變基因克隆到載體上，其下游緊接兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)。前一酶切位點(diǎn)是5‘突出，后一酶切位點(diǎn)是3’突出第43頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月ExoIII催化線性雙鏈DNA或有缺口環(huán)狀DNA自3‘-OH端逐一釋放5’單核甘酸。適當(dāng)時(shí)機(jī)終止酶切反應(yīng)缺口填補(bǔ)，類似物摻入DNA鏈的一處或多處第44頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月S1核酸酶處理單鏈末端，形成平末端50％基因攜帶有錯(cuò)配的堿基，導(dǎo)致位點(diǎn)變異第45頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)第46頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月一.目標(biāo)蛋白在E.coli中的表達(dá)在E.coli

中表達(dá)蛋白是非常簡單,快速和便宜的。有很多商品化和非商品化的載體，在N-末端或C-末端有標(biāo)簽（tag),并有很多菌株供使用者選擇。TheexpressionofproteinsinE.coliistheeasiest,quickestandcheapestmethod.Therearemanycommercialandnon-commercialexpressionvectorsavailablewithdifferentN-andC-terminaltagsandmanydifferentstrainswhichareoptimizedforspecialapplications.第48頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)

1.遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚

2.容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵

3.外源基因?？梢愿咝П磉_(dá)第49頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月不足

1.不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾

2.限制二硫鍵的形成，多亞基復(fù)合體的組裝

3.外源基因易形成不溶性的包涵體第50頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

表達(dá)載體（expressingvector)

用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體，除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。

原核細(xì)胞表達(dá)載體，E.coli真核細(xì)胞表達(dá)載體，yeast,mammaliancell第51頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月RecombinantproteinscanbeproducedinE.colicellsusingspecificexpressionvectors.BasicelementsformakinganE.coli

expressionvector第52頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月

表達(dá)載體的一般特點(diǎn)

復(fù)制起始點(diǎn)選擇性基因強(qiáng)的，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)合適的多克隆位點(diǎn)第53頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素1）有效的轉(zhuǎn)錄起始2）有效地翻譯3）蛋白質(zhì)水解作用4）蛋白質(zhì)的外泌第54頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3.蛋白質(zhì)表達(dá)的方法Atypicalexpressionexperimentconsistsofthefollowingstep:Pickingofasinglecolonyfromafreshlystreakedplateoftheexpressionhostcontainingtherecombinantvector.Growingofastarterculture.Inoculate(接種)withthepickedcolonyupto50mlofrichmedium(suchasLBor2xYT)containingtheappropriateantibiotic.Whenalargerstartercultureisrequired,inoculate4mlofrichmediawiththesinglecolony;growfor4-8hoursat37°C;andusethistoinoculatethestarterculture.第55頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月InoculationofthemaincultureandincubationuntilOD600reaches0.4-1.TheoptimalODvaluedependsontheculturemethodandthemedium.ForflaskculturesusingLB-mediumanOD600

of

0.6isrecommended.Toincreasethegrowthrate,wecarryouttheculturesat37°CuntiltheODforinductionisreached.Thentheculturesarecooledtotheinductiontemperatureinice-water.Inductionofproteinexpression.Proteinexpressionisinducedbytheadditionoftheproperinducerorbychangingthegrowthconditions.Fromthispointonthecellswillusemostoftheirresourcesfortheproductionofthetargetproteinandwillnotgrowmuchfurther.第56頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Forthemostusedpromotersinductionconditionsarelistedbelow.Promoter

induction

typicalcondition

rangetrc(hybrid)additionofIPTG0.2mM0.05-2.0mMaraBADadditionofl-arabinose0.2%0.002-0.4%PL

liftingthetemperaturefrom37to42CT7-lacoperatoradditionofIPTG0.2mM0.05-2.0mM

第57頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Afterinductiontheculturesareincubatedfrom3hourstoovernightdependingontheinductiontemperature.Incubationtemperatureincubationtime15°Covernight20°Covernight25°Covernight30°C5-6h37°C3-4hHarvestingofthecellpelletbycentrifugation(20minat6000g).Cellpelletsarestoredat-20°C.第58頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4.改善表達(dá)水平及溶解性的方法1）如何改善表達(dá)水平

誘導(dǎo)條件（時(shí)間、溫度的最適條件）外源基因的編碼序列（密碼子）用蛋白酶缺失的宿主菌

第59頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2）如何改善外源蛋白的溶解性

Inmanycasestheexpressedproteinisinsolubleandaccumulatesinso-calledinclusionbodies(包含體).Thisisespeciallytrueunderconditionsofhighlevelexpression.Severalstrategiesareavailabletoimprovethesolubilityoftheexpressedprotein.第60頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Reducingtherateofproteinsynthesis.

(降低蛋白合成速度）Thiscanbedoneby:loweringthegrowthtemperature.Thisdecreasestherateofproteinsynthesisandusuallymoresolubleproteinisobtained.usingaweakerpromoter(e.g.

trcinsteadofT7).usingalowercopynumberplasmid.loweringtheinducerconcentration.第61頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.Changingthegrowthmedium.（改變生長介質(zhì)）

additionofprostethicgroupsorco-factorswhichareessentialforproperfoldingorforproteinstability.additionofbuffertocontrolpHfluctuationinthemediumduringgrowth.additionof1%glucosetorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).additionofpolyols(e.g.sorbitol山梨醇)andsucrose.Theincreaseinosmoticpressure(滲透壓)causedbytheseadditionsleadstotheaccumulationofosmoprotectantsinthecell,whichstabilizethenativeproteinstructure.additionofethanol,lowmolecularweightthiolsanddisulfides,andNaCl.第62頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Co-expressionofchaperonesand/orfoldases.（與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)）

Twoclassesofproteinsplayanimportantroleininvivoproteinfolding.Molecularchaperonespromotetheproperisomerizationandcellulartargetingbytransientlyinteractingwithfoldingintermediates.ThebestcharacterizedE.colisystemsare:GroES-GroEL

DnaK-DnaJ-GrpE

ClpB

第63頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月GroEL/GroES復(fù)合物GroESGroEL第64頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第65頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第66頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Foldasesacceleraterate-limitingstepsalongthefoldingpathway.Threetypesoffoldasesplayanimportantrole:peptidylprolylcis/transisomerases(PPI's肽基脯氨酰異構(gòu)酶)disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC)proteindisulfideisomerase(PDI)-aneukaryoticproteinthatcatalyzesbothproteincysteineoxidationanddisulfidebondisomerization.Italsoexhibitschaperoneactivity.第67頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Co-expressionofoneormoreoftheseproteinswiththetargetproteincouldleadtohigherlevelsofsolubleprotein.Thelevelsofco-expressionofthedifferentchaperones/foldaseshavetobeoptimizedforeachindividualcase.DsbAandDsbChavealsoshownpossitiveeffectsonexpressionlevelswhenusedasafusionpartner.第68頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4.Periplasmicexpression.

（外泌表達(dá)）Secretionofthetargetproteintotheperiplasm（周質(zhì)）

hasanumberofdistinctadvantages:theoxidizingenvironmentoftheperiplasmallowsfortheformationofdisulfidebonds,whichdoesnotoccurinthereducingenvironmentofthecytoplasm.theperiplasmcontainstwofoldases,disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC),thatcatalyzetheformationandisomerizationofdisulfidebonds.reducedproteolysis(sincelessproteinsarepresent).allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.engineeringofanauthentic(可信的)N-terminus.第69頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Secretionisachievedbytheadditionofaleadersequence(signalpeptide)totheN-terminusofthetargetprotein.MostusedleadersequencesarepelBandompT.Unfortunately,expressionyieldareusuallymuchlowerandnotallexpressedproteinissecretedintotheperiplasmbutisalsofoundinthemedium,thecytoplasmandthecytoplasmicmembrane.第70頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5.Usingspecifichoststrains.

（用特殊宿主菌）Thesolubilityofdisulfidebondcontainingproteincanbeincreasedbyusingahoststrainwithamoreoxidizingcytoplasmicenvironment.Twostrainsarecommerciallyavailable(Novagen):AD494,whichhasamutationinthioredoxinreductase(trxB).Origami,adoublemutantinthioredoxinreductase(trxB)andglutathionereductase(gor).第71頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月6.Additionofafusionpartner.(附加融合蛋白)

FusionoftheN-terminusofaheterologousproteintotheC-terminusofasolublefusionpartneroftenimprovesthesolubilityofthefusionprotein.7.Expressionofafragmentoftheprotein.

(表達(dá)蛋白片斷)E.colidoesnotexpresswellverylargeproteins(>70kDa).Choosingasmallerfragmentofthetargetproteincanimproveexpressionlevelsandsolubility.Thesolubilityofapoorlysoluble(orinsoluble)proteincanalsobeimprovedbyselectingonlyasolubledomainforexpression.第72頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月8.Invitrodenaturationandrefoldingoftheprotein.

(蛋白體外變性,再折疊)Whendespitealleffortsthetargetproteinstillisexpressedininclusionbodies,thenthelastresortistodenatureandrefoldtheproteininvitro.Thisprocedureiscarriedoutinthreephases:isolationoftheinclusionbodies.solubilizationanddenaturationofthetargetprotein.Thisisdonebytheadditionofadenaturingagent(usuallyguanidineorurea)underreducingconditions(e.g.20mMDTT).refoldingoftheproteinbyremovingthedenaturatingagentusingdialysis,dilutionorchromatography.Forproteinscontainingdisulfidebondsthishastobecarriedoutinthepresenceofaredoxshuttlingsysteme.g.reducedandoxidizedglutathione.第73頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3)如何改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性Ingeneralproperlyfoldedproteinarequitestable.Theprecisestructuralfeaturesthatimpartstabilitytoproteinsarenotknown.Nonetheless,somedeterminantsofproteininstabilityhavebeenelucidated.第74頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月N-endrule.

InE.coliN-terminalArg,Lys,Leu,Phe,Tyr,andTrpresiduesgreatlydecreasethehalf-lifeoftheprotein.AtestproteinwiththeseresiduesintheN-terminalpositionshowedhalf-lifesofonly2minutescomparedtomorethan10hourswithallotheraminoacids(exceptproline).

2.PESThypothesis.

IneukaryotesproteinsaredestabilizedbyregionsenrichedinPro,Glu,Ser,andThr.

第75頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Sometimesthelevelsofproteinexpressionarelowbecauseofhighlevelofproteaolyticdegradationofthetargetprotein.Thefollowingapproachescanbeusedtoimporvetheexpressionlevel:i.Usingprotease-deficienthoststrains.Theuseofhoststrainscarryingmutationswhicheliminatetheproductionofproteasescansometimesenhanceaccumulationbyreducingproteolyticdegradation.BL21,theworkhorseofE.coliexpression,isdeficientintwoproteasesencodedbythelon(cytoplasmic)andompT(periplasmic)genes.第76頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月ii.Periplasmicexpression.Intheperiplasmproteolyticdegradartionofproteinsisdecreased.Thisismainlybecausethetotalnumberofproteinsintheperiplasmislower.iii.Decreasingthegrowthtemperature.Reducingthegrowthtemperaturewillresultinslowerproteinproductionbutalsoinslowerproteolyticdegradation.Theoverallresultisoftenanincreasedexpressionlevelofthetargetprotein.第77頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月4）如何減少蛋白質(zhì)的毒性Lowexpressionlevelsornoexpressionatallcanalsobecausedbytoxicityofthetargetprotein.Proteintoxicitycanmanifestitselfondifferentlevels:第78頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Incompleterepressionofproteinexpression.

Manypromotersarenotverytightlyregulatedandshowsomedegreeofexpressionbeforetheadditionoftheinducer.Especiallylacpromotersareleaky.Oftenthisleakinessleadstoplasmidinstabilityand/orlossofplasmid.Asaconsequencetheculturewillbeovergrowbycellsthathavelosttheplasmid(especiallywhenampicillinisusedasaselectablemarker)orwillnotgrowatall.

Differentapproachescanbeusedtogiveamoretightlyregulatedexpression:第79頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月constitutiveexpressionofarepressorprotein.InthecaseofthelacpromoterbytheexpressionofthelacrepressorfromthelacIorlacIqgene.FormediumcopynumberplasmidsitissufficienttouseahoststraincarryingthelacIqallele(等位基因).Highercopynumberplasmidsshouldcontaintherepressorgeneonthevector.useamoretightlyregulatedpromoter,e.g.thearabinosepromoter(PBAD).usealowercopynumberplasmid.

第80頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月constitutiveexpressionofphageT7lysozymefromacompatiblepLysSorpLysEplasmid(Novagen).LysozymebindstoT7RNApolymeraseandinactivatestheenzyme.AftertheadditionofIPTGtheexpressionlevelofthepolymerasewillbemuchhigherthanthatoflysozymeandthiswillovercometherepression.additionof1%glucosetotheculturemediumtorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).第81頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.Besidestighteningregulation,otherapproachesexisttopreventlosingtheexpressionvectorfromthecells.

useofelevatedlevelsofantibiotics(upto200mg/ml).usethe"plating"methodforinoculatingcultures.Culturesareinoculatedbyscrapingoffagarplates第82頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Toxicityuponinduction.Someproteinsaresotoxicforthecellsthattheydonotonlyinhibitgrowthbutalsokillthem.Thus,almostimmediatelyafterinductioncellsdieandexpressionlevelswillbeverylow.Severalapproachesarepossibletodecreasetheeffectsofproteintoxicity:periplasmicexpression.Secretionofthetargetproteintotheperiplasm(orthemedium)allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.expressionininclusionbodies.Althoughdifficulttodirectitisadvantageoustoexpresstoxicproteinininclusionbodies.Inaggregatestheproteinsarenottoxicforthecellandtheycanbeobtainedbyinvitrodenaturationandrefolding.第83頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月5）如何蛋白質(zhì)共表達(dá)Theco-expressionofproteinsthatplayaroleinregulationofexpression,suchasT7lysozymethatisexpressedfromthepLysSorpLysEvector.Strainscontainingthesevectorarecommerciallyavailable.Theco-expressionoftherarecodontRNAs.TwostrainexpressingdifferentsetsofrarecodontRNAsarecommerciallyavailablefromStratagene.第84頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月Differentmethodsexistfortheco-expressionoftwoormoreproteins:1.Co-expressionfromdifferentvectors.Toensureplasmidstability,thevectorsshouldhave:differentselectablemarkers,usuallyantibioticresistencemarkers.differentoriginsofreplication.第85頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月2.Co-expressionfromonevector.Thegenesareclonedintothesamevectorandcouldbeexpressedfromoneormorepromoters.Ifclonedundertheregulationofonepromoter,theorderinwhichthegenesareclonedusuallyaffectstheexpressionlevelsoftheproteins.Therefore,severalconstructsshouldbemadeinwhichthegenesareclonedinadifferentordertooptimizetheexpressionoftheproteins.Itisageneralobservationthatgenesarebetterexpressedwhentheyfollowagenecodingforahighlysolubleprotein.3.Mixtureofthetwoabovementionedmethods.

第86頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月二.目標(biāo)蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)YeastisaneukaryoticorganismandhassomeadvantagesanddisadvantagesoverE.coli.Oneofthemajoradvantagesisthatyeastculturescanbegrowntoveryhighdensities,whichmakesthemespeciallyusefulfortheproductionofisotopelabeledproteinforNMR.ThetwomostusedyeaststrainsareSaccharomycescerevisiaeandthemethylotrophicyeastPichiapastoris.

第87頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：外源蛋白的第一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)。

將DNA引入酵母強(qiáng)堿處理（常用Li）或電擊轉(zhuǎn)化酵母選擇性標(biāo)志營養(yǎng)缺陷型的基因（Leu-,His-,Trp-)第88頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺陷和解決方法翻譯異源蛋白時(shí)，遺傳和翻譯的穩(wěn)定性常受影響，如點(diǎn)突變。翻譯產(chǎn)物不穩(wěn)定有時(shí)產(chǎn)物無活性生產(chǎn)分泌蛋白時(shí)，蛋白有一過長的氨基末端過度糖基化蛋白折疊和分泌在酵母中蛋白量表達(dá)很高第89頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月有關(guān)酵母表達(dá)載體的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和篩選1）載體

YeastcloningvectorsaregenerallyconstructedasE.coli-yeastshuttlevectors,whichcomprisereplicatingplasmids(YRp-type),episomalplasmids

(YEp-type,酵母附加體質(zhì)粒),centrometricplasmids(YCp-type，酵母著絲點(diǎn)質(zhì)粒),andintegratingplasmids(YIp-type)第90頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月第91頁，課件共102頁，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)外源基因常用的啟動(dòng)子

啟動(dòng)子

培養(yǎng)條件表達(dá)調(diào)控類型醇脫氫酶（ADHI）2－5％glucose組成性醇脫氫酶（ADHII）0.1－0.2％glucose