生化技術親和層析

生化技術親和層析第1頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月物質分離純化的依據(jù)

利用各分離物質理化特性的差異性但由于分離方法的特異性不強，導致分離純化的收得率較低；為了解決這一問題，一種有效的分離方法應運而生——親和層析第2頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月親和層析的概念

利用被分離的（生命大分子）物質和特異性配體之間能可逆性結合與解離的原理而建立的層析方法第3頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基本原理第4頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基本原理1.親和層析載體的組成配體L以共價鍵結合到活化的基質M上，構成固相載體2.原理首先待分離物質S借助靜電引力、范得華力及結構互補效應等作用吸附于固相載體上，與其它物質分離；然后通過改變起始緩沖液的pH值，或增加離子強度，或加競爭性抑制劑等方法使待分離物從固相載體上脫離下來第5頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月二、分類特異性配體親和層析：配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、受體、酶的類似物等）。其特點是吸附特異性強，結合力大通用性配體親和層析：配體一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料、氨基酸等）。其成本低，具有較高的吸附容量，但分辨率不及前者第6頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月三、特點優(yōu)點：上樣量大，分辨率高，操作步驟少，被分離物質的活性不易喪失缺點：每分離一種物質都必須找到合適的配體，并將其制備成固相載體第7頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)操作第8頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基質的選擇一種理想的親和層析基質應滿足的條件特異性強（非特異性吸附少）高度的親水性性質穩(wěn)定具有大量容易被活化的基團，且容易與配體結合適當?shù)目讖胶秃Y孔數(shù)目第9頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月常用親和吸附劑采用的基質

一般有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纖維素：具有非特異吸附性，且本身結構不均一聚丙烯酰胺凝膠和交聯(lián)葡聚糖：與配體結合后，多孔性會大大降低，且聚丙烯酰胺凝膠具有大量酰胺鍵，不易在載體與配體之間引入間隔物玻璃珠：具有多孔性好，機械性能強等優(yōu)點，但對有的物質也有一定的吸附力

目前使用最廣泛的是Sepharose4B，它是有D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖結合成的鏈狀多糖，極易用溴化氰活化，并易于引入不同基團；在溫和條件下可連接較多的配體，容易吸附大分子物質，且吸附容量較大第10頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月二、配體的選擇

通?？晒┻x擇的配體有抑制劑、效應物、酶的輔助因子、類似底物、抗體及其他物質（如凝集素、polyA、polyU、染料和金屬等）等第11頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月1.與被純化物質有適宜的親和力

一般來說，配體對大分子物質的親合力越高，在親和層析時，分辨率就越好，應用價值就越高；但若配體與待純化物質（生物大分子物質）之間的親合力太大時，對分離純化是不利的如：用抗生物素蛋白（亦稱親和素）作為配體純化含生物素的羧化酶時，由于抗生物素蛋白-生物素解離常數(shù)接近1×10-15mol，要其分離，必須在6mol/L鹽酸胍溶液，pH1.5的劇烈條件下才能使羧化酶釋放出來，而在此條件下，羧化酶的活性大部分已發(fā)生不可逆性喪失第12頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2.具有與基質共價結合的基團

該基團和基質結合后，對配體與待純化物質的親合力沒有影響或影響不明顯第13頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月三、親和吸附劑的制備偶聯(lián)方法物理方法包埋法和吸附法等化學方法偶聯(lián)法：利用CNBr、環(huán)氧氯丙烷、雙環(huán)氧乙烯、丁二烯砜、亞胺二烯酸等化學試劑使配體與活化的基質偶聯(lián)或形成螯合物交聯(lián)法：即用戊二醛、碳二亞胺等雙功能試劑交聯(lián)基質與配體

CNBr是最常用的偶聯(lián)劑，偶聯(lián)過程分為基質的活化、偶聯(lián)、去除未結合配體、配體結合量的測定等步驟第14頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月1.活化將一定量的貯存基質用布氏漏斗抽干，然后加入等量的D.W和2mol/L溶液（pH11~12），混勻稱取適量固體CNBr（50~300mg/g貯存膠），溶于二甲基甲酰胺溶液中活化：將溶好的CNBr溶液加入瓊脂糖懸浮液中活化洗滌：將冷卻的反應液轉入布氏漏斗中，用10~20倍體積的預冷水及0.07mol/L溶液（pH8.5）洗滌第15頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月邊加邊攪拌反應液應始終保持pH11~12反應會放熱，要用水浴中加碎冰的方法控制溫度在20℃維持8~10min后，再加入大量碎冰使反映體系快速冷卻至4℃或更低溫度整個活化過程越快越好：因為活化的Sepharose在堿性條件下不穩(wěn)定注意第16頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2.偶聯(lián)

向已經(jīng)活化和洗滌的基質中加入等體積的0.2~0.25mol/L緩沖液（含0.5mol/L

NaCl和1~10μmol/ml）混合，緩慢攪拌（室溫2h;4℃過夜）至配體與基質充分偶聯(lián)注意：對于偶聯(lián)極牢固（如多結合位點）會失活的大分子物質配體，則應在低pH（6.0~6.5）緩沖液中反應；或將活化的基質事先置pH8.3的堿性溶液中部分水解，適當降低其偶聯(lián)活性；從而提高配體的活性第17頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月3.洗滌

在基質和配體偶聯(lián)后的溶液中加入用HCl調pH9.0的乙醇胺溶液，在攪拌下反應15min，或在弱堿溶液中放置過夜，或在Tris-HCl溶液，pH8.0，放置2h；然后室溫條件下分別用NaHCO3溶液、Na2B4O7溶液、NaCl溶液洗滌吸附劑，除去過剩的配體和乙醇胺第18頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月4.配體結合量的測定

配體結合量是表示吸附劑中束縛的配體濃度的指標，通常作為決定親和吸附劑實際用量的參數(shù)。一般用每毫升或每克貯存膠束縛的配體量來表示，如mg/ml

其測定方法有直接測定法和間接測定法第19頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）直接測定法①2,4,6-三硝基苯磺酸鈉的顏色試驗

在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的勻漿液中加入1ml飽和的硼酸鈉溶液，3滴3%的2,4,6-三硝基苯磺酸鹽水溶液，室溫反應2h。不同的親和吸附劑具有不同的顏色：未被配體取代的基質呈黃色配體為脂肪族氨基衍生物的呈橙色配體為芳香族氨基衍生物的呈橙紅色未取代的肼衍生物呈深紅色然后根據(jù)各種顯色物質的吸光度值計算配體的含量（比色法）第20頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月②根據(jù)配體的特性進行測定

首先用適當?shù)姆椒▽⑴潴w和基質分離開，然后根據(jù)各種配體的特性，用相應的方法測定（在相同的條件下，用一定量的配體和未活化的基質混合液作標準對照，計算出配體的含量）第21頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）間接測定法①推算法

將偶聯(lián)過程中加入配體的量減去偶聯(lián)后洗脫出來的配體量，除以沉積膠的量，即可推算出配體的結合量（如mg/g沉積膠）②根據(jù)親和吸附劑對被吸附物的操作容量計算配體的結合量

將親和吸附劑裝入柱中，加入待分離大分子物質，使其結合量達到最大，先用適當?shù)南礈靹┫慈ルs質，然后用特異性洗脫劑洗出待分離的大分子物質，根據(jù)分離出的大分子物質的量，計算配體的結合量將少量純品大分子物質陸續(xù)加入到親和層析柱中，直至飽和平衡，然后根據(jù)上樣量推算出配體的結合量第22頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月四、特異性吸附

當樣品加入到已知的具有一定濃度的親和層析柱時，欲分離的大分子物質就會逐步進入層析柱中，和配體結合成復合物；隨著樣品的加入，復合物的濃度越來越大，呈恒定增加。由于配體的存在，使樣品中有效成分的移動受到阻礙，從而形成緊密的復合物帶，由于不同組分與吸附劑的結合能力不同，所以可得到分離和純化

樣品中有效成分在親和吸附劑上的吸附量，除與它們之間的親合力有關外，還與樣品的pH值、離子強度和反應時間有關例1圖7-6，Sepharose-氨基乙酰-D色氨酸甲酯親和層析研究發(fā)現(xiàn)

①在高pH條件下，吸附劑對α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大

②在高離子強度條件下，吸附劑對α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小例2用Con.A-Sepharose親和層析柱分離γ-球蛋白時，上樣后反應1h比3h得率高第23頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月五、分離大分子物質

上樣后，可用大量平衡液（即起始緩沖液）洗去無親和力的雜蛋白，有時也可用不同的緩沖液洗滌，使柱子上只剩下專一吸附的大分子物質；最后用相應的洗脫劑洗脫有效成分，其具體操作方法可根據(jù)配體與有效成分的親合力決定①親合力較小時，可用大體積的平衡液洗脫，得到遲緩的大分子物質峰②親合力一般時，主要靠改變緩沖液的性質（如改變pH或離子強度或者同時改變pH和離子強度），降低復合物之間的親合力而解離洗脫注意：用酸性或堿性pH值洗脫是，可得到十分集中的蛋白峰，但洗脫收集的蛋白質液應立即中和、稀釋或透析，以免造成有效成分活性喪失③親合力較強時，可用與配體競爭的溶液或用蛋白質變性劑洗脫第24頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭性洗脫劑專一性強，并能洗脫出和配體特異性結合的大分子物質；但洗脫需要的洗脫液較多劇烈的洗脫條件如用鹽酸胍、尿素等變性劑配制的溶液洗脫蛋白質等生命大分子物質時洗脫液須及時處理恢復有效成分的活性；如透析法等第25頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月六、親和層析柱的再生

用過的親和層析柱應連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，并用平衡緩沖液重新平衡層析柱第26頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)提高吸附劑的操作容量第27頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月影響吸附劑操作容量的因素①配體的性質②配體在吸附劑中的含量③配體與吸附物結合時的位阻效應大小④基質的多孔性⑤操作條件第28頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月一、在配體和基質間引入“手臂”1.原理在配體和基質間引入“手臂”，使配體離開基質的骨架，減小基質的立體（空間）位阻效應，增加配體的活動度和伸入溶液的深度，提高吸附劑的操作容量（特別使用于小分子配體）例用對氨基苯硫代吡喃作為配體，Sepharose4B為基質純化β-半乳糖苷酶時，如果將配體直接連接在基質上，則不能吸附β-半乳糖苷酶，而當在基質和配體之間引入3,3’-二氨基二丙胺琥珀酰胺手臂時，則可有效吸附β-半乳糖苷酶注意：并非手臂越長越好，因為太長可能折疊彎曲，反而降低吸附容量第29頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月2.吸附劑衍生物的制備①瓊脂糖活化②將氨基化合物（如1,6-己二胺;6-氨基己酸等）共價結合于活化的瓊脂糖上制成穩(wěn)定的瓊脂糖衍生物③在碳二亞胺存在下，基質通過手臂與含羧基或氨基的任何化合物結合成固相載體④將瓊脂糖衍生物與溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反應后，再與含氨基、酚羥基和咪唑基等基團的化合物反應，即可生成一系列具有不同長度“手臂”的親和吸附劑第30頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月二、增加配體取代的程度對于解離常數(shù)較大的配體而言，增加配體在基質中的濃度也是增加吸附劑結合量的有效方法

①在配體量一定時，可通過提高基質活化時的pH值和增加CNBr的用量，增加基質活性基團的數(shù)量，從而增加基質對配體的偶聯(lián)量②當基質活化度一定時，可通過提高偶聯(lián)反應液的pH值或增加配體濃度來增加配體的偶聯(lián)量第31頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月三、配體與基質以最小的鍵連接配體以較少的共價鍵連接到載體時，有利于保持蛋白質、多肽類配體自身的高級結構狀態(tài)，保持其生物活性。蛋白質一般以非質子化形式的游離-NH2與活化的基質反應，當偶連反應在pH＞9.5條件下進行時，配體的大量游離氨基都會與基質連接，而在相對不利的pH條件下（如pH＜7.0）進行時，就能減少配體與基質連接的鍵

例：在pH6.0～6.5條件下偶聯(lián)的抗體衍生物較pH9.5偶聯(lián)的衍生物對抗原的吸附量高得多第32頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月四、基質多孔性的影響

親和層析的基質多用生物膠（聚丙烯酰胺凝膠）和瓊脂糖凝膠，但生物膠在偶聯(lián)配體后會導致多孔性降低，致使結合物（被分離組分）不能滲透到凝膠篩孔中與配體結合；而瓊脂糖多孔性的穩(wěn)定性較生物膠好，故多選擇瓊脂糖作為基質提高吸附劑的吸附容量第33頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月五、其他樣品濃度、pH值、離子強度、上樣速度等因素也會對提高操作容量產(chǎn)生影響第34頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)應用實例第35頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年