種子制備和菌種保藏

種子制備和菌種保藏第1頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月斜面沙土管冷干管液氮管實(shí)驗(yàn)室種子制備生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)種子制備

二級(jí)斜面一級(jí)斜面米孢子母瓶

子瓶一級(jí)種子罐發(fā)酵罐

二級(jí)種子罐三級(jí)種子罐菌種保藏生產(chǎn)種子制備的一般流程第2頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月幾個(gè)概念1.種子罐級(jí)數(shù)：種子在種子罐中需擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。種子罐級(jí)數(shù)確定根據(jù)：（1）菌種生長(zhǎng)特性（2）孢子數(shù)量（3）孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度（4）發(fā)酵罐的接種量2.發(fā)酵級(jí)數(shù)：種子罐的級(jí)數(shù)加一。二級(jí)發(fā)酵，即一級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如青霉素，四環(huán)素；三級(jí)發(fā)酵，即二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如紅霉素、慶大霉素；四級(jí)發(fā)酵，即三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如鏈霉素。種子級(jí)數(shù)愈少，愈有利于簡(jiǎn)化工藝和控制，并減少了因多次接種而產(chǎn)生污染的機(jī)會(huì)。第3頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.接種齡：生產(chǎn)種子的培養(yǎng)時(shí)間，即指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時(shí)間。接種齡以菌絲處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達(dá)到最高峰時(shí)為宜。4.接種量：指移入的種子液體積與接種后培養(yǎng)液體積比例。最適接種量為7~15%。第4頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)種子制備一、斜面種子的制備1.斜面種子：在試管或扁瓶?jī)?nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面上生長(zhǎng)的菌種培養(yǎng)物。2.制備流程：3.制備過(guò)程注意事項(xiàng)：

(1)

瓊脂要完全浸沒(méi)在營(yíng)養(yǎng)液內(nèi),用量1.0%-2.5%(2)營(yíng)養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物；

(3)

裝量掌握在斜面頂端不超過(guò)試管或扁平長(zhǎng)度的2/3；

(4)滅菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以減少冷凝水

(5)微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入第5頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在無(wú)菌間超凈工作臺(tái)進(jìn)行接種操作第6頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.質(zhì)量檢查

（1）外觀檢查（菌落的形態(tài)、色澤、稀密度、孢子量、色素分泌）（2）無(wú)菌檢查（3）搖瓶生產(chǎn)能力檢查

第7頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.影響斜面種子質(zhì)量的因素(1)原材料質(zhì)量，水質(zhì)，培養(yǎng)基pH

(2)滅菌條件

(3)接種量

(4)培養(yǎng)室溫度、濕度、通風(fēng)

(5)培養(yǎng)時(shí)間

(6)有害氣體或揮發(fā)物（培養(yǎng)室內(nèi)不要安紫外燈）

(7)冷藏條件第8頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、米粒種子（米孢子）

1.米孢子：將霉菌或放線菌接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后產(chǎn)生的分生孢子。2.米孢子制備工藝流程3.

制備過(guò)程注意事項(xiàng)（1）浸泡時(shí)間及加營(yíng)養(yǎng)液量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透但不粘連；（2）分裝量應(yīng)掌握在平鋪后有2-3粒米的厚度（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培養(yǎng)前期應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)米粒，使微生物在米粒表面生長(zhǎng)均勻，氣生菌絲及孢子長(zhǎng)成后不再搖動(dòng)。（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存第9頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

（1）無(wú)雜菌污染（2）孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高（3）生產(chǎn)能力高

(4)真空干燥后含水量小于10%5.影響質(zhì)量的因素及控制（同前）三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同米粒種子）

第11頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、搖瓶種子

1.搖瓶種子:

將斜面種子或米孢子接種于錐形搖瓶?jī)?nèi)的液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子。

2.制備流程:3.制備過(guò)程注意事項(xiàng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量應(yīng)較斜面豐富，以確保一定的營(yíng)養(yǎng)菌體生長(zhǎng)量；能保持生長(zhǎng)過(guò)程中pH穩(wěn)定。培養(yǎng)基裝量適當(dāng)，以保證良好的通氣并與發(fā)酵罐通氣條件相適應(yīng)；參考裝量為40-50ml/250ml瓶，60-80ml/500ml瓶，90-110ml/750ml瓶，120-150ml/1000ml瓶；如果是厭氧培養(yǎng)，則裝量應(yīng)增加一倍以上；3)滅菌時(shí)要注意不要讓蒸汽冷凝水打濕或粘污培養(yǎng)基在瓶塞或紗布上4）注意搖床轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速越快，偏心距越大，通氣越好。經(jīng)常檢查，皮帶松弛時(shí)要緊一緊。5）注意搖床中心與邊緣、上層與下層的溫差

第12頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月?lián)u瓶種子制備流程第13頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.質(zhì)量檢查：(1)

菌體濃度：外觀稠度，靜置沉降率，離心沉降率。(2)

菌體生長(zhǎng)階段：顯微鏡檢查細(xì)胞分化情況。(3)代謝情況：對(duì)殘余糖、氮進(jìn)行化學(xué)分析，并測(cè)量pH值。(4)

生產(chǎn)能力：搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。(5)

污染雜菌情況：鏡檢及無(wú)菌試驗(yàn)檢查

4.影響質(zhì)量的因素

第14頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、發(fā)酵罐種子1.制備流程：

斜面、搖瓶或米粒種子↓培養(yǎng)基配制→實(shí)罐或連續(xù)滅菌→冷卻→火圈或壓力差接種→培養(yǎng)→發(fā)酵罐種子

第15頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.制備過(guò)程注意事項(xiàng)培養(yǎng)基要求與發(fā)酵培養(yǎng)基大致相同，較搖瓶培養(yǎng)基豐富，控制培養(yǎng)基成份的合理配比2)接種方式：一級(jí)種子罐：火圈保護(hù)接種法和壓差法二級(jí)種子罐：壓差法3）通氣培養(yǎng)時(shí)通入空氣的溫度適中（20-50℃），攪拌轉(zhuǎn)速也要適當(dāng)。4）采用夾套或蛇管冷卻以保持恒溫，溫度不能高于控制溫度，防止造成異常發(fā)酵5）通過(guò)培養(yǎng)基中生理酸堿性物質(zhì)的配比，使pH自然維持在適宜的范圍6）控制合適移種量：確定合適的移種量：過(guò)大或過(guò)小都對(duì)發(fā)酵有不利影響掌握種子罐的放罐體積。第16頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月壓差法接種操作示意第17頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第18頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月種子罐1

發(fā)酵罐1發(fā)酵罐2種子罐2①①②③④移種方式：1）單種2）雙種3）倒種4）混種第19頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.質(zhì)量檢查及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1）不污染雜菌2）菌體生長(zhǎng)階段（種齡）：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，菌體量未達(dá)到高峰3）菌體濃度：菌體濃度的測(cè)定方法：離心沉淀法、光密度法、細(xì)胞記數(shù)法等4）糖、氮、磷代謝情況5）種子液pH6）搖瓶試驗(yàn)的發(fā)酵水平7）特異性酶活力第20頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月種齡對(duì)發(fā)酵的影響第21頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.影響質(zhì)量的因素5.種子代謝緩慢原因分析空氣溫度偏低局部燙傷培養(yǎng)基原材料質(zhì)量差培養(yǎng)基滅菌溫度太高，營(yíng)養(yǎng)成分破壞多無(wú)機(jī)磷量低接種量太小前一級(jí)種子質(zhì)量太差泡沫多通氣差第22頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)菌種保藏定義：將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。一、條件及原理

1.

低營(yíng)養(yǎng)2.

干燥3.隔氧4.低溫

降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)(孢子、芽孢等）5.密封保持干燥、隔氧、純粹第23頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、常用的菌種保藏方法單純傳代保存法（斜面或穿刺）斜面法：實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，適用于細(xì)菌或酵母。方法：從沙土管、安瓿管或其它藏物內(nèi)取出少量菌種或制成懸浮液接入新鮮的斜面上，在一定的溫度下培養(yǎng)，生長(zhǎng)成熟后，2-4℃冰箱保存。優(yōu)點(diǎn)：是操作簡(jiǎn)單，使用方便缺點(diǎn)：是保存期短，在不斷的傳代過(guò)程中，菌種容易變異，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。第24頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.結(jié)合單孢子分離的傳代保存法斜面→孢子懸浮液→稀釋涂布→單細(xì)胞分離培養(yǎng)→挑菌→高產(chǎn)菌株的篩選→高產(chǎn)菌株的保藏4℃冰箱，3-6個(gè)月適用于遺傳不穩(wěn)定的菌種,既保藏了菌種，又保持了生產(chǎn)能力3.石蠟油封藏法方法：在長(zhǎng)好菌的斜面試管中，加入滅過(guò)菌的液體石蠟，可防止培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，從而降低微生物的代謝活動(dòng)，推遲細(xì)胞老化，延長(zhǎng)保存時(shí)間。優(yōu)點(diǎn)：保存期比斜面低溫法保存時(shí)間長(zhǎng)，適用范圍廣，真菌、放線菌都適用。第25頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.沙土管保存保存抗生素生產(chǎn)菌常用的方法，目前使用最廣泛的保藏方法。優(yōu)點(diǎn)：效果好，操作方便，保存期可達(dá)一年以上方法：將處理過(guò)的細(xì)沙與土按1：2混合，分裝沙土管中1cm高，加棉塞，于121℃滅菌1h，間歇滅菌3-5次。接孢子懸液于沙土管中，抽真空。干燥后于4℃冰箱中保存。1-3年保存期。適用于霉菌、放線菌和形成芽孢的細(xì)菌的保藏第26頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.米孢子保存步驟與米孢子的制備類似密封，4℃冰箱3-6個(gè)月；真空抽干后密封，保藏6-12個(gè)月。適用于霉菌的保藏6.低溫凍結(jié)保藏法將保存的菌種（孢子或菌體）懸浮于滅菌的10%-20%甘油或二甲亞基亞砜保護(hù)劑中，低溫冰箱（-20—-70℃）凍結(jié)。保存溫度視菌種不同而異，保存期1-2年。優(yōu)點(diǎn)：存活力高，變異率低，使用方便第27頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7.冷凍干燥管保存（lyophilizationfreeze-drying)原理：在較低的溫度下，即-15℃以下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并且利用保護(hù)劑（脫脂牛奶或血清）保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長(zhǎng)和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異。因此微生物一般可保存5-10年。優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間長(zhǎng)，存活力高，變異率低缺點(diǎn)：制備工藝較復(fù)雜，需要保護(hù)劑、真空干燥和冷藏設(shè)備，費(fèi)用較貴。方法：收集菌種滅菌脫脂牛奶或馬血清作為懸浮介質(zhì)

滅菌安瓿管預(yù)凍低溫真空凍干密封，

適用于一切微生物的保存。第28頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)胞10%-20%甘油作為懸浮介質(zhì)分裝入安瓿瓶?jī)?nèi)預(yù)凍置液氮內(nèi)（-196℃），

適用于所有微生物、動(dòng)物和植物細(xì)胞的保存液氮超低溫保藏法原理：微生物在-130℃的低溫下，所有的代謝活動(dòng)都暫停而生命延續(xù)，微生物菌種得以長(zhǎng)期保存。保存期：5~15年。優(yōu)點(diǎn)：存活率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，保存期最長(zhǎng)，適用范圍最廣缺點(diǎn)：需具備液氮和超低溫冷凍條件，不易推廣，一般保存經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的菌種。方法：第29頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9、基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第30頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡(jiǎn)介菌種是一個(gè)國(guó)家的重要生物資源，所以菌種保藏是一項(xiàng)重要的菌物學(xué)工作。隨著科技的進(jìn)步和生產(chǎn)的發(fā)展，對(duì)菌物資源的利用正在不斷擴(kuò)大，所以菌種保藏工作顯得更加重要。目的：廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于研究、交換、使用的目的。第31頁(yè)，課件共33頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以下是幾個(gè)國(guó)際上規(guī)模較大的菌種保藏機(jī)構(gòu)：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC，AmericanTypeCultureCollection，Maryland，USA)美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究中心（NRRL，NorthronRegionalReseachCenterLaboratory，AgriculturalResearchService.U.S.DepartmentofAgriculture,Peria,Illinois,USA)英聯(lián)邦國(guó)際菌物研究所（CMI）英國(guó)國(guó)家酵母菌保藏所（NCYC）荷蘭菌物菌種中心保藏所（CBS）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，ChinaCenterforTypeCultureCollection）是中國(guó)專利局指定的用于專利程序培養(yǎng)物的保藏機(jī)構(gòu)，