抗體制備技術(shù)培訓(xùn)課件

抗體制備技術(shù)一.抗體相關(guān)知識(shí)二.抗體產(chǎn)生三.抗體純化四.抗體檢測(cè)2抗體制備技術(shù)抗原：能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答,并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體)發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。

特性：免疫原性和反應(yīng)原性。

完全抗原：多為分子量大于5KD的蛋白質(zhì)。其它如脂多糖，脂蛋白，糖蛋白，多糖體，核酸與蛋白的結(jié)合物。

半抗原：與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答

。如某些激素、藥物、多肽等?？乖瓫Q定簇：又稱表位（Epitope），指抗原性物質(zhì)表面決定該抗原特異性的特殊化學(xué)基因。它可由5—7個(gè)AA，單糖或核苷酸殘基決定。一.抗體相關(guān)常識(shí)

3抗體制備技術(shù)

抗體是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過(guò)動(dòng)物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對(duì)其他無(wú)關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個(gè)不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對(duì)多個(gè)不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對(duì)同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonalantibody），簡(jiǎn)稱多抗。4抗體制備技術(shù)FcFabAgIgG可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段Fc(Fragmentcrystalline)

是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時(shí)呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段無(wú)抗體活性，但具有IgG特有的抗原性Fab(Fragmentantigenbingding)

該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個(gè)抗原分子

由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學(xué)試驗(yàn)等使用中帶來(lái)許多麻煩。因此，制備針對(duì)預(yù)定抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無(wú)限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長(zhǎng)期夢(mèng)寐以求的目標(biāo)。5抗體制備技術(shù)

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無(wú)限制生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無(wú)限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過(guò)克隆化可得到來(lái)自單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對(duì)同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體，簡(jiǎn)稱單抗。6抗體制備技術(shù)雜交瘤技術(shù)過(guò)程7抗體制備技術(shù)雜交瘤技術(shù)原理-細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶）

2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK（胸腺嘧啶核苷激酶）

3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）8抗體制備技術(shù)雜交瘤技術(shù)原理-HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞（B細(xì)胞）（B細(xì)胞惡性腫瘤）1.抗體分泌（Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生長(zhǎng)2.8-AG篩選出HGPRT-株

PEG融合HAT篩選

脾-骨髓瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）

（HGPRT+、Ig+）

9抗體制備技術(shù)抗原抗體反應(yīng)

1．電荷引力(庫(kù)倫引力或靜電引力)。這是抗原抗體分子帶有相反電荷的氨基和羧基基團(tuán)之間相互吸引的力。這種引力和兩電荷間的距離的平方成反比。兩個(gè)電荷越接近，靜電引力越強(qiáng)。反之，這種引力便很微弱。2．范德華引力。這是原子與原子、分子與分子互相接近時(shí)發(fā)生的一種吸引力，實(shí)際上也是電荷引起的引力。由于抗原與抗體兩個(gè)不同大分子外層軌道上電子之間相互作用，使得兩者電子云中的偶極擺而產(chǎn)生吸引力，促使抗原抗體相互結(jié)合。這種引力的能量小于靜電引力。3．氫鍵結(jié)合力。氫鍵是由分子中的氫原子和電負(fù)性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。當(dāng)具有親水基團(tuán)（例如－OH，－NH2及－COOH）的抗體與相對(duì)應(yīng)的抗原彼此接近時(shí)，可形成氫鍵橋梁，使抗原與抗體相互結(jié)合。氫鍵結(jié)合力較范登華引力強(qiáng)，并更具有特異性，因?yàn)樗枰泄潴w和受氫體才能實(shí)現(xiàn)氫鍵結(jié)合。4．疏水作用。抗原抗體分子側(cè)鏈上的非極性氨基酸（如亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中與水分子間不形成氫鍵。當(dāng)抗原表位與抗體結(jié)合點(diǎn)靠近時(shí)，相互間正、負(fù)極性消失，由于靜電引力形成的親水層也立即失去，排斥了兩者之間的水分子，從而促進(jìn)抗原與抗體間的相互吸引而結(jié)合。這種疏水結(jié)合對(duì)于抗原抗體的結(jié)合是很重要的，提供的作用力最大?？乖c抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩中分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。10抗體制備技術(shù)Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細(xì)胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)，稀釋單抗和多抗產(chǎn)生區(qū)別示意圖雜交瘤細(xì)胞+PEG,融合Ab2二.抗體產(chǎn)生

11抗體制備技術(shù)多肽偶聯(lián)動(dòng)物免疫采集血樣血清制備多抗/單抗共有程序細(xì)胞融合細(xì)胞篩選亞克隆細(xì)胞凍存腹水生產(chǎn)單抗獨(dú)有程序12抗體制備技術(shù)多肽-載體偶聯(lián)

化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，因而與載體蛋白偶聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)。好的載體蛋白應(yīng)具有好的抗原性、可溶性和較多的偶聯(lián)基團(tuán)。用于與多肽偶聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽偶聯(lián)載體。BSA也常用來(lái)作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測(cè)試驗(yàn)的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。

13抗體制備技術(shù)將樣品溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的組分分離出來(lái)。14抗體制備技術(shù)半抗原——載體效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組別初次免疫再次免疫抗DNP抗體1BSA-DNPBSA-DNP+++2BSA-DNPOVA-DNP+3BSA-DNP-OVAOVA-DNP+++

為什么單獨(dú)應(yīng)用半抗原不能產(chǎn)生抗體，載體在抗體產(chǎn)生中發(fā)揮什么作用？

只有當(dāng)初次與再次免疫時(shí),半抗原需要在相同載體上才能產(chǎn)生半抗原抗體，稱此為載體效應(yīng)。證明載體不是單純起運(yùn)載半抗原的作用，而是具有載體特異性。因此提出一個(gè)完全抗原分子，必須具有載體決定簇和半抗原決定簇。

70年代應(yīng)用載體效應(yīng)過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，證明了在抗體形成過(guò)程中，有對(duì)載體特異的細(xì)胞和對(duì)半抗原特異的細(xì)胞，分別稱為載體反應(yīng)細(xì)胞和半抗原反應(yīng)細(xì)胞。并進(jìn)一步證明T細(xì)胞是載體反應(yīng)細(xì)胞，對(duì)抗體產(chǎn)生起輔助作用。B細(xì)胞是半抗原反應(yīng)細(xì)胞，是產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，自此闡明了載體效應(yīng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

15抗體制備技術(shù)（一）動(dòng)物選擇

要生成好的抗體，必須選擇與抗原源差異較大的動(dòng)物。要想獲得最大的免疫反應(yīng)，絕對(duì)不能讓免疫動(dòng)物對(duì)抗原產(chǎn)生‘自體識(shí)別’。作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類，主要為羊、兔、鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用日本大耳白兔、山羊和小鼠等。用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無(wú)感染性疾患，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。生產(chǎn)多克隆抗體大多選用新西蘭兔和日本大耳白兔，一組二只，初次免疫時(shí)兔的體重以不小于2kg為宜，要求兩耳光滑，明顯可見耳靜、動(dòng)脈。

生產(chǎn)單克隆抗體時(shí)根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。就小鼠而言，一組三只，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。動(dòng)物免疫

16抗體制備技術(shù)（二）動(dòng)物免疫

免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或肌肉多位點(diǎn)注射。由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入免疫佐劑刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

佐劑除了可以使抗原緩慢釋放，從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。多克隆抗體兔免疫：雙肩皮下兩點(diǎn)和雙后腿肌肉兩點(diǎn)單克隆抗體鼠常規(guī)免疫：頸后部皮下一點(diǎn)、雙后腿肌肉兩點(diǎn)和腹腔單克隆抗體鼠加強(qiáng)免疫：尾靜脈和腹腔17抗體制備技術(shù)（三）免疫程序多克隆抗體免疫程序時(shí)間單克隆抗體免疫程序采集免疫前血液10ml/兔第0天采集免疫前血清30ul/鼠第一次免疫200ug/兔，加CFA第2天第一次免疫100ug/鼠，加CFA第二次免疫200ug/兔，加CFA第16天第二次免疫50ug/鼠，加IFA第三次免疫100ug/兔，加IFA第30天第三次免疫50ug/鼠，加IFA第一次采集免疫后血液20-30ml/兔第36天第一次采集免疫后血液30ul/鼠第四次免疫100ug/兔，第37天第四次免疫50ug/鼠，ELISA檢測(cè)

ELISA、WB檢測(cè)第二次采集免疫后血液20-30ml/兔第43天第二次采集免疫后血液30ul/鼠第五次免疫100ug/兔，第44天第五次免疫50ug/鼠，若陰性，繼續(xù)ELISA檢測(cè)

若陰性，繼續(xù)ELISA、WB檢測(cè)第三次采集免疫后血液20-30ml/兔第50天第三次采集免疫后血液30ul/鼠第六次免疫100ug/兔，第51天第六次免疫50ug/鼠，

加強(qiáng)免疫：40ug/鼠，18抗體制備技術(shù)血樣的采集、制備與保存

抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測(cè)抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要7-10天左右時(shí)間，然后才可進(jìn)行耳動(dòng)脈取血工作。抓放實(shí)驗(yàn)兔動(dòng)作應(yīng)輕緩，一手抓住兔子雙耳，另一只手托住兔子臀部，操作過(guò)程中避免壓迫兔子內(nèi)臟。用95%的酒精棉球反復(fù)檫拭至血管充分充盈后開始采血，在采血過(guò)程中繼續(xù)檫拭。采血完畢用干棉球止血。

收集的血液置于室溫下析出血清，1800rpm離心20min,吸出血清（兩次）。19抗體制備技術(shù)抗血清的保存1.4℃保存，將抗血清清除菌后，液體狀態(tài)保存于普通冰箱，可以存放3個(gè)月到半年，效價(jià)高時(shí)，一年之內(nèi)不會(huì)影響使用。保存時(shí)要加入0.1％～0.2％NaN3以防腐。如若加入半量的甘油則保存期可延長(zhǎng)。2.低溫保存，放在－20～－40，一般保存5年效價(jià)不會(huì)有明顯下降，但應(yīng)防止反復(fù)凍融，反復(fù)凍融幾次則效價(jià)明顯降低。因此低溫保存應(yīng)用小包裝，以備取出后在短期內(nèi)用完。3.冰凍干燥，最后制品內(nèi)水分不應(yīng)高于0.2％，封裝后可以長(zhǎng)期保存，一般在冰箱中5～10年內(nèi)效價(jià)不會(huì)明顯降低。

20抗體制備技術(shù)細(xì)胞融合

細(xì)胞融合（cellfusion）是指在離體條件下用人工方法將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。利用細(xì)胞融合技術(shù)使不同的細(xì)胞融合成一個(gè)新的雜合細(xì)胞，這個(gè)新的細(xì)胞就獲得了兩個(gè)親本細(xì)胞的遺傳信息和細(xì)胞質(zhì)，從而具備有兩個(gè)親本細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞融合是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的過(guò)程，可分為骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備、脾細(xì)胞分離、融合操作等三個(gè)步驟。21抗體制備技術(shù)1.將骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞1500rpm離心5min，棄上清；2.用20mlCA液重懸脾細(xì)胞后轉(zhuǎn)入有骨髓瘤細(xì)胞的50ml離心管中并重懸細(xì)胞；3.1500rpm離心5min，棄上清。4.輕敲離心管，使細(xì)胞完全分散,置于37℃水浴中；5.在60秒內(nèi)勻速緩慢滴加lmlPEG1500，同時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管使混合均勻；6.37℃水浴中輕搖30秒，靜置60秒；7.在2min內(nèi)加入2mlCA液，再在2min內(nèi)加入8mlCA液，同時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管；8.離心管置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10min；9.1500rpm離心10min，棄上清，取10mlCB液重懸細(xì)胞。10.轉(zhuǎn)移5ml融合細(xì)胞的重懸液至加樣槽中，加入95mlCB液、1ml細(xì)胞生長(zhǎng)因子后混合均勻制成細(xì)胞懸液；11.按200ul/well加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；細(xì)胞融合-融合操作22抗體制備技術(shù)細(xì)胞篩選

雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱為抗體檢測(cè)?？贵w檢測(cè)的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡(jiǎn)便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào)告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說(shuō)來(lái)，在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè)方法，并克服可能存在的問(wèn)題。23抗體制備技術(shù)亞克隆

從原始孔中得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，可能來(lái)源于多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克?。?，也需要克隆化。另外，長(zhǎng)期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測(cè)抗體分泌情況。通常在得到針對(duì)預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化，有時(shí)還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程?？寺』姆椒ê芏啵詈?jiǎn)單也是使用最廣泛的兩種方法是梯度稀釋法和有限稀釋法。24抗體制備技術(shù)亞克隆-梯度稀釋法ABCDEFGH12345678910111225抗體制備技術(shù)亞克隆-有限稀釋法ABCD12345626抗體制備技術(shù)雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

（1）

雜交瘤細(xì)胞的凍存

在建立雜交瘤細(xì)胞的過(guò)程中，有時(shí)一次融合產(chǎn)生很多“陽(yáng)性”孔，來(lái)不及對(duì)所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來(lái)；另一方面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來(lái)災(zāi)難，通常盡可能早地凍存一部分細(xì)胞作為種子，以免遭到不測(cè)。在雜交瘤細(xì)胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時(shí)取用。

細(xì)胞凍存的原理是細(xì)胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度,可在-196℃液氮或液氮蒸氣中長(zhǎng)期保存。（2）

雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞在液氮中保存，若無(wú)意外情況時(shí)，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復(fù)蘇時(shí)融解細(xì)胞速度要快，使之迅速通過(guò)最易受損的-5℃—0℃，以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。27抗體制備技術(shù)腹水生產(chǎn)

單抗的大規(guī)模生產(chǎn)

目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng)，一是動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法，這是國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用；另一是體外培養(yǎng)法。

動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法

迄今為止，通常情況下均采用動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法，鑒于絕大多數(shù)動(dòng)物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得，因此使用的動(dòng)物當(dāng)然首選BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢娫摲ú僮骱?jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，不過(guò)，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動(dòng)物病毒的危險(xiǎn)，故而最好用SPF級(jí)小鼠。

a.

腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.5ml。

b.

7-10天后腹腔接種用PBS稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠3×106/0.5ml。

c.

間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可用16號(hào)針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采5-20ml腹水；

d.

將腹水離心（3000r/min10分鐘），除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?8抗體制備技術(shù)三.抗體純化飽和硫酸銨沉淀法ProteinA/ProteinG親和純化法抗原親和純化法29抗體制備技術(shù)抗體純化-SAS純化

硫酸氨沉淀是從溶液中分離蛋白質(zhì)的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術(shù)，可以用來(lái)分離大部分膜蛋白，免疫球蛋白會(huì)殘留于溶液中。在溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)通過(guò)暴露于外的極性和離子基團(tuán)同水分子形成氫鍵。加入像氨或硫酸根這樣的小分子可以使蛋白質(zhì)失去結(jié)合的水分子，從而使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)。硫酸氨沉淀法難以得到高純度的抗體。其它大分子蛋白和混入絮狀沉淀中的蛋白會(huì)造成對(duì)抗體的污染。我們可以將硫酸氨沉淀做為蛋白質(zhì)純化的一步，并采用其它方法對(duì)得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。血清50%SAS

上清(白蛋白)沉淀(球蛋白)33%SAS上清沉淀(擬球蛋白)(γ球蛋白)30抗體制備技術(shù)抗體純化-ProteinA或ProteinG純化γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，約占全部免疫球蛋白的75％。A蛋白或G蛋白對(duì)IgG抗體Fc臂具有特異吸附，此特性可用于純化IgG抗體。對(duì)不同物種產(chǎn)生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差別。比如，G蛋白適合羊IgG，但A蛋白不具有此特性。從A蛋白和G蛋白柱上洗脫抗體時(shí)，須非常小心，以免抗體變性。使用前樣品結(jié)合洗脫31抗體制備技術(shù)抗體純化-抗原親和純化抗原親和純化法同A蛋白和G蛋白不同，這種方法不能取得非特異性的Ig部分。在此方法中，抗原首先共價(jià)結(jié)合于分離柱上的固定相。這樣，多抗樣品中對(duì)此抗原有特異吸附的抗體將由于同抗原的吸附而留在分離柱上。未能結(jié)合的抗體將從分離柱上首先被洗脫，進(jìn)一步洗脫將得到特異性抗體。用抗原親和純化法得到的抗體具有很高的特異性。32抗體制備技術(shù)四.抗體檢測(cè)檢測(cè)方法：

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)

WesternBlot(WB)

Immunohistochemistry(IHC)

DotBlot(DB)檢測(cè)步驟：抗原固相化抗原與抗體的反應(yīng)抗體與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)酶催化底物發(fā)光或顯色33抗體制備技術(shù)血清稀釋度陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照10204080160320640128025605120可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體的量成正比，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。35抗體制備技術(shù)抗體檢測(cè)-WBSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是與質(zhì)量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。36抗體制備技術(shù)SDSProteinboil37