液相色譜柱知識

高效液相色譜儀使用中常見問題及對策高效液相色譜（HPLC）作為一種分離技術(shù)和方法，目前已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)全新的階段。高精度的輸液泵，應(yīng)用廣泛的色譜分離柱，低噪音、高靈敏度的各種檢測器和功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)的出現(xiàn)，都推動了液相色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展。液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)倍受儀器分析工作者的青睞，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測等領(lǐng)域。作者本人從事液相色譜分析工作二十多年，應(yīng)用HPLC技術(shù)在血藥濃度、生物胺、核苷酸、蛋白質(zhì)濃度測定等實(shí)際工作中，積累了許多的方法和經(jīng)驗(yàn)，在這里與大家交流，希望能對同行們有所幫助和借鑒，共同促進(jìn)液相色譜分析技術(shù)的發(fā)展。1高效液相色譜儀的基本工作原理高效液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。高壓泵從溶液貯器中抽走流動相，流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測器，使已被分離的組分逐一被檢測器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蠼?jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對記錄的峰值進(jìn)行存儲和計(jì)算［1］。液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對運(yùn)動的兩相（液相和固相）中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動相。當(dāng)液體樣品在載體流動相的推動下，在液-固兩相間作相對運(yùn)動時(shí)，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)（K）不同，則使各自的移動速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配，從而達(dá)到使混合物分離的目的。上式反映了物質(zhì)在兩相中進(jìn)行吸附、解吸、再吸附、再解吸…過程中，由于在兩相中濃度的不同，而存在分配系數(shù)上的差異。既然分配系數(shù)及其差異是引起組分在液相色譜柱分離的根本原因，那么，必然地也會同色譜理論中可測宏觀量之間存在著某種定量關(guān)系，事實(shí)上，色譜理論中通常用容量因子k’的概念來反映物質(zhì)在兩相中的分配關(guān)系：k’值可以非常方便地表達(dá)組分在兩相的分配，又很容易從色譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中直接測得，是色譜理論中重要的基本參數(shù)之一［2］。2輸液泵的常見故障及對策輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。1單向閥故障由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。氣泡進(jìn)入閥中會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會明顯改變。此時(shí)，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量（2ml/min）沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾櫇癖脙?nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊［3］。采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因?yàn)檫@會損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動而流動相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí)，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：使用超純水（18MQ.cm）、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相；配好的流動相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也最好在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。泵在起動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。3色譜分離柱的使用與維護(hù)在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。1怎樣維護(hù)好色譜分離柱加保護(hù)柱（預(yù)柱）是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵啟動太快、柱切換等操作。用手動進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會造成壓力沖擊。合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測組分的分子量的大小；二是根據(jù)流動相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動相PH值在3-7之間，極端PH值（＞8）的流動相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料（如Waters公司的XTerra色譜柱），集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬（1-12）的優(yōu)勢，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對象、流動相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙月青沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。2怎樣減少柱的污染？最有效的辦法是純化樣品。我們在多年的分析工作中發(fā)現(xiàn)，凡是樣品純化的越干凈，分離柱的壽命就越長；反之，只有提取沒有純化的樣品，分離柱柱效下降較快。建立一個(gè)理想的色譜分析方法應(yīng)該有一套有效的樣品前處理方法，特別是在分析血漿和尿液樣品時(shí)，要特別注意樣品的提取與純化，盡量使處理過的樣品中雜質(zhì)（如大分子蛋白、有機(jī)物等）降到最低，保護(hù)柱頭和柱子。提取純化好的樣品最好用流動相來溶解，一方面減少色譜圖中的溶劑峰干擾，另一方面也是檢查樣品在流動相中的溶解性，如果樣品進(jìn)樣后在流動相中沉淀，會堵塞進(jìn)樣器和柱頭，甚至樣品分解，出現(xiàn)怪峰。如果出現(xiàn)樣品與流動相不溶要設(shè)法改變?nèi)芙鈼l件，如更換樣品溶劑，或改進(jìn)處理樣品的方法，或過濾，去除不溶性物質(zhì)。4檢測器的常見故障及對策液相色譜儀常用的檢測器主要有紫外、熒光和電化學(xué)檢測器。這些檢測器的作用就是收集流經(jīng)色譜分離柱的各組分在檢測器中的信號，根據(jù)組分光吸收值/熒光強(qiáng)度/電極表面電流的變化計(jì)算出組分的濃度［4］。各檢測器常見故障主要有：1基線噪音較大和對策對于紫外檢測器，氘燈光源打開后要預(yù)熱30分鐘以上，基線才能穩(wěn)定。氘燈用的過久，接近受命期時(shí)（氘燈的壽命約束1000小時(shí)），會使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時(shí)更換氘燈。除光源外，流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。怎樣判斷基線噪音增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡？可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪音立即停止，基線呈一條直線，說明基線噪音來自流動相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣；若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極（安培型）對氣泡十分敏感，儀器的平衡時(shí)間較長。流路中如果有氣泡存在，不僅基線會出現(xiàn)尖峰，還會影響檢測。因此，做電化學(xué)檢測時(shí)，流動相的配制要很嚴(yán)格，水要超純、除還原物，配好后一定要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué)分析專用儀器，而是普通的高效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液鈍化（注意斷開分離柱），可縮短基線平衡時(shí)間。還可在流動相中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中，光靠泵沖有時(shí)太慢，可暫時(shí)將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表面，也很奏效的，但對液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸。2檢測器污染及對策管道污染阻塞是檢測器常見故障。當(dāng)流動相用了緩沖鹽更換流動相又不當(dāng)時(shí)，常會在檢測器管路中產(chǎn)生沉淀，可先用5倍柱積的水沖洗，再用10倍柱積的強(qiáng)溶劑（如乙月青）流過，再用50倍的柱體積的異丙醇沖洗，最后換上反相流動相平衡。當(dāng)檢測器管路堵塞時(shí)，可表現(xiàn)為柱壓升高，此時(shí)，應(yīng)和柱頭堵塞相區(qū)分。可斷開柱子，直接接檢測器，如泵壓仍較高，可判斷壓力升高是由于檢測器管道堵塞造成。檢測器進(jìn)口是常發(fā)生阻塞的地方，正向沖洗效果常不明顯，我們的經(jīng)驗(yàn)是將檢測器進(jìn)出口管道對調(diào)，用6mol/L硝酸溶液反沖檢測器，能很快將阻塞沖開，但要注意用低流速沖洗，觀察壓力變化。檢測池阻塞和污染多見紫外檢測器。池阻塞也可用上述方法反沖，一般都能疏通。通常，池阻塞的故障比較少見，而池污染常發(fā)生，如不干凈的樣品在池窗上積聚等，都會造成檢測池污染。表現(xiàn)為基線噪音增大，儀器靈敏度下降?？捎米⑸淦饕来嘶爻楫惐肌?mol/L硝酸，要小心操作，將池中的污物沖洗干凈，最后用100ml純水正向沖洗檢測池。反向沖洗還可防止池滲漏。對于電化學(xué)檢測器，要注意維護(hù)工作電極表面的清潔度，當(dāng)檢測器檢測了大量較臟的樣品（如血漿、尿液）或用的過久，應(yīng)用化學(xué)法或物理拋光法對電極表面進(jìn)行清潔，可提高一定的檢測靈敏度，但要注意，最后一定要用純水沖洗干凈，不要帶來其它污染。我們僅就有限的篇幅談了一點(diǎn)從事液相色譜分析工作的經(jīng)驗(yàn)，還有許多問題需要我們大家共同交流和探討。高效液相色譜儀是現(xiàn)代科學(xué)研究中廣泛使用的分析儀器，但我們必須學(xué)會正確的使用和維護(hù)，才能更好的駕馭它，讓HPLC技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。怎樣選擇高效液相色譜柱？現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。1、 正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)（NH2,APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。2、 反相色譜反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1?14均可使用。相對與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。三、其他無機(jī)填料其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1?14，溫度可達(dá)100°C。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。怎樣選擇填料粒度目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，

3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時(shí)間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙月青代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。一、如何保證良好的柱性能與柱壽命?認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書；?使用填充良好的色譜柱；?盡量減少壓力波動，避免機(jī)械及熱沖擊；?使用保護(hù)柱及在線過濾器；?經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；?充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；?用穩(wěn)定的固定相（C18最穩(wěn)定）；?在中等PH值操作（6?8），用有機(jī)緩沖溶液；?色譜柱使用溫度最好小于40°C；?硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH值范圍在3.0?8.0；?在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；?流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95：5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；?過夜或貯存時(shí)，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動相保存（乙晴最好）。HPLC固定相及應(yīng)用范圍名稱別名功能基團(tuán)正相反相離子對應(yīng)用非極性和Silica -OH非極性和中等極性以及非離子性有機(jī)化合物。在所有的烷基SASC1 -(CH3)3在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留最ButylC4 -C4H9質(zhì)，保留時(shí)間比ButylC4 -C4H9質(zhì)，保留時(shí)間比C8和C18短。MOS C8, -C8H17等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，Octyl性藥族化合物和環(huán)境樣品。ODSC18 -C18H37等極性化合物保留最強(qiáng)。廣CPSCN,Cyano-(CH2)3CNV性，適合應(yīng)用于正相(propyl;與C8和Nitrile)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)用廣泛。APSNH2 -(CH2)3NH2極性化合物。弱陰離子交(AminoPropyl)和有機(jī)酸則應(yīng)用緩沖劑和有機(jī)改性弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物.VV分離肽和蛋白V V中等極性相中對中極V V烷基鍵合相中對中泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品.V 對極性化合物有獨(dú)特的選擇分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時(shí)，其選擇性C18不同，在藥學(xué)領(lǐng)VV 反相中分析糖類和其他換，陰離子劑做流動相。正相中與硅膠的選擇性機(jī)改性不同，分析芳香族效果很好。Phenyl-(CH3)C6H5J芳香族化合物Diol質(zhì)。正相時(shí)，與硅選擇-(CH2)2O反相時(shí)，分離肽和蛋白CH2(CH2OH)2性相似,但極性較弱。SCX強(qiáng)陽離子-(CH2)2C6H4SO3H-V有機(jī)堿交換SAX強(qiáng)陰離子-(CH2)3N+(CH3)3SAX強(qiáng)陰離子-(CH2)3N+(CH3)3有機(jī)酸，核苷和核苷酸交換液相色譜柱的選擇、使用、維護(hù)和常見故障及排除液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱；反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重點(diǎn)介紹反相色譜柱的選擇和使用：一、反相色譜柱的選擇柱子的PH值使用范圍反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時(shí)，會導(dǎo)致鍵合相的水解；當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí)，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。填料的端基封尾（或稱封口）把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。3.戴安公司Acclaim柱子介紹一極性封尾C16固定相柱戴安公司有28種類型的柱子，Acclaim反相柱填料高純，金屬含量極低，完全封尾。PH2-9范圍內(nèi)兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim極性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O鏈接鍵的色譜柱，具極低的硅羥基活性，能在極性溶劑甚至100%水的條件下長期使用。對酸性和堿性化合物有極為尖銳的好的色譜峰形，與現(xiàn)有的一流色譜柱相比有更好的立體選擇性。（下圖是Acclaim極性封尾C16柱和市售極性封尾一流色譜柱分離酸性化合物譜圖的比較）二、液相色譜柱的使用色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測試所使用的條件是最佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。1、 樣品的前處理a、 最好使用流動相溶解樣品。b、 使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、 使用0.45以m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。2、 流動相的配制液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點(diǎn)：a、 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時(shí)間保留在柱中）。b、 流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)c、 流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。d、 流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。e、 流動相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。f、 在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、 流動相流速的選擇因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量:）。注意：含水流動相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。流動相要求使用0.45Mm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。色譜柱的維護(hù)色譜柱的平衡反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙月帶水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的”補(bǔ)償”，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！操作步驟：平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水”過渡”即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。色譜柱的再生長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）?？梢詫ιV柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。建議用來沖洗柱子的溶劑體積色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積125-4mm1.6ml30ml250-4mm3.2ml60ml250-10mm20ml400ml選擇再生方法：極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：正庚烷f氯仿f乙酸乙酯f丙酮f乙醇…水**非極性固定相（如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等）的再生：水f乙腈f氯仿（或異丙醇）f乙月青f水在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全

洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。色譜柱的維護(hù)使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2—7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍避免流動相組成及極性的劇烈變化流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙月青中氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。二、如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題分離效果變差流動相組分改變保留因子分離效果變差流動相組分改變保留因子（k），柱效變1.保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析問題原因表現(xiàn)不同色譜柱間差異填料、鍵合相不同保留因子（k），分離因子（a）使用期間柱變化柱床破壞柱效（N）鍵合相丟失保留因子（k），分離子（a）硅膠基質(zhì)溶解柱效（N）強(qiáng)保留分堆積堵塞保留因子（k），柱效（N）柱外效應(yīng)系統(tǒng)差異，進(jìn)樣量大、柱效（N）進(jìn)樣閥與色譜柱之間、色譜柱與檢測器之間管路太長、檢測器流通池體積大、接頭死體積大等?；苄×魉俑淖儽Ａ粢蜃樱╧）,分離因子(a)溫度改變保留因子（k）,柱效變化很小柱平衡慢重新平衡時(shí)間不夠保留因子（k）,柱效變化很小柱超載樣品量太大保留因子（k）,柱效（N）造成色譜峰（不對稱）拖尾的原因色譜柱本身填裝問題，篩板堵塞或填料塌陷;柱頭有污染；3樣品超載；4樣品溶劑不合適；5.柱外效應(yīng)；6化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；7緩沖容量不足或不合適；8重金屬污染。如何解決峰形拖尾的問題與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題流動相中，加入30mM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；降低進(jìn)樣量至《lug。與色譜柱有關(guān)的拖尾問題如柱頭處有強(qiáng)保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混合液