primer5和oligo結(jié)合設(shè)計(jì)引物步驟及心得

primer5Oligostepby1、在NCBI上搜索到目的 的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。2、用 5搜索引①打開Primer 5，點(diǎn)擊File-New-DNAsequence,出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer， 到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCRprimers”，“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00～200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300～5④對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)Tm應(yīng)該在55～70度之間，GC％應(yīng)該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息， 如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5.Primer5File-Print-CurrentpairPDF虛擬Pdf文檔，①在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來兩個(gè)窗口，分別為InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會(huì)出來引物定位 入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過點(diǎn)擊－Currentoligolength來改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利 yze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。 yzeKeyinfoSelectedprimers，會(huì)給出兩條引物的概括TmOligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會(huì)比Primer5TmDeltaG3’DeltaG.3’DeltaGDNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一9。③yzeDuplexFormation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或r/LowerPCR反應(yīng)異常的重要Oligo3’DeltaG值。 yzeHairpinFormation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析。可以選擇上游或者下游引物，同樣，DeltaG4.5kcal/mol3個(gè)。yzeCompositionandTm，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)TmGC40％～60％，而且上下游引物GCTm3nearestneighbormethod、％GCmethod2(A＋T)＋4(G＋C)methodPrimer5所采用的方法，Tm50～70度之間。第五項(xiàng)為FalsePrimingSites，即錯(cuò)誤 位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有Falsepriming分析，但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會(huì)給我正確 效率在100以下當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的 效率很高的話比如達(dá)到400～ 效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。⑤yze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是“PCR”PCPCRDeltaG值偏大的話，Oligo在DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析窗口（若存在可疑的異常的話）PCR窗口。4、引物確定后，對(duì)于上游和下游引物分別進(jìn)行Blast分析，一般來說，多少都會(huì)找到 的同源序列，此時(shí)，可以對(duì)上游引物和下游引物的blast結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析， 1、Primer5.0②PCRProductsize100－500bp100bpPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠③Searchparameters還是選Manual吧，Searchstringency應(yīng)選High，GC含量一40－60％。其它參數(shù)默認(rèn)就可以了。3端≥2A或T,GC3端≥2G或C，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。對(duì)于這樣的引2、Oligo6.0①在yzeDuplexFormationThemoststable3’-Dimer4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall絕65°的時(shí)候，Themostst