細胞周期(講座)教學課件

細胞周期(講座)1、合法而穩(wěn)定的權力在使用得當時很少遇到抵抗。——塞·約翰遜2、權力會使人漸漸失去溫厚善良的美德。——伯克3、最大限度地行使權力總是令人反感；權力不易確定之處始終存在著危險。——塞·約翰遜4、權力會奴化一切?！髻?、雖然權力是一頭固執(zhí)的熊，可是金子可以拉著它的鼻子走?！勘燃毎芷?講座)細胞周期(講座)1、合法而穩(wěn)定的權力在使用得當時很少遇到抵抗。——塞·約翰遜2、權力會使人漸漸失去溫厚善良的美德?！?、最大限度地行使權力總是令人反感；權力不易確定之處始終存在著危險?！ぜs翰遜4、權力會奴化一切?！髻?、雖然權力是一頭固執(zhí)的熊，可是金子可以拉著它的鼻子走?！勘燃毎鲋?cellproliferation)細胞周期(cellcycle)細胞分裂（celldivision)一、細胞增殖(cellproliferation)的意義一個受精卵發(fā)育為初生嬰兒，細胞數(shù)目增至1012個，長至成年有1014個，約200種類型,而成人體內每秒鐘仍有數(shù)百萬新細胞產生，以補償血細胞、小腸粘膜細胞和上皮細胞等的衰老和死亡。◆細胞增殖(cellproliferation)是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎?！魡渭毎锛毎鲋硨е律飩€體數(shù)量的增加。◆多細胞生物由一個單細胞(受精卵)分裂發(fā)育而來，細胞增殖是多細胞生物繁殖基礎。◆成體生物仍然需要細胞增殖，主要取代衰老死亡的細胞,維持個體細胞數(shù)量的相對平衡和機體的正常功能◆機體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復等，都要依賴細胞增殖。二、細胞周期(cellcycle)◆概念：

細胞周期的概念由Howard和Pelc,在1953年提出。一次細胞分裂結束到下一次分裂完成所經歷的一個有序過程。其間細胞遺傳物質和其他內含物分配給子細胞。也稱細胞生活周期(celllifecycle)或細胞繁殖周期(cellreproductivecycle)（細胞周期是第一次分裂開始到第二次分裂開始所經歷的全過程?！镀胀ㄉ飳W》陳閱增）◆歷史：

●上世紀50年代以前，有絲分裂期

（mitosis）、間期(interphase)。

●1953年Howard和Pelc用32P的磷酸鹽作為標記物浸泡蠶豆發(fā)芽，取根尖作放射自顯影發(fā)現(xiàn):DAN合成期(DANsynthesisphase，S期)。

第一時間間隔期（firstgap，

G1期）。

第二時間間隔期（secondgap，

G2期）。

提出：細胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉（標準細胞周期，standardcellcycle)。

●1957年，3H-TdR放射自顯影、Feulgen染色等證實：該細胞周期在動、植物細胞增殖中普遍存在。（一）細胞周期的時相組成

G1(Gap1)

間期S(DNAsynthesis) G2(Gap2)細胞周期 分裂期M

前期（prophase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase）（一）細胞周期時相組成·間期(interphase):G1phase，Sphase，G2phase·分裂期（Mphase）:有絲分裂(Mitosis)和減數(shù)分裂(Meiosis）·分裂期（Mphase）：Mitosis(nucleardivision)Cytokinesis(cytoplasmicdivision)

細胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉，在間期細胞體積增大(生長)，在M期細胞先是核分裂,接著胞質分裂，完成一個細胞周期。細胞周期ThecellcycleOverviewofthecellcycleThemostbasicfunctionofthecellcycleistoduplicateaccuratelythevastamountofDNAinthechromosomesandthensegregatethecopiespreciselyintotwogeneticallyidenticaldaughtercells.大多數(shù)大多數(shù)昆蟲的受精卵、某些菌類和藻類先進行多次核分裂，形成多核細胞，然后再發(fā)生胞質分裂，在核間形成質膜，從而形成一個細胞一個核。黏菌則不發(fā)生胞質分裂。骨骼肌細胞也有多核現(xiàn)象。

（二）細胞周期時間·不同細胞的細胞周期時間差異很大·S+G2+M的時間變化較小,G1期的時間變化大·有些分裂增殖的細胞缺乏G1、G2期如蛙胚卵裂哺乳動物細胞周期的時間（hr）細胞類型TCTG1TSTG2+M人結腸上皮細胞259142直腸上皮細胞4833105胃上皮細胞249123骨髓細胞182124大鼠十二脂腸隱窩細胞10.42.27.01.2內釉質上皮細胞27.316.08.03.3肝細胞47.528.016.03.5·TC

＝TG1+TS+TG2+

TMTC:（細胞周期時間）·S+G2+M的時間變化較小,G1期的時間變化大

·細胞周期時間測定：細胞周期的時間長短與細胞類型有關，如：小鼠十二指腸上皮細胞的周期為10小時，人類胃上皮細胞24小時，骨髓細胞18小時，培養(yǎng)的人成纖維細胞18小時，CHO細胞14小時，HeLa細胞21小時。不同類型細胞的G1長短不同，是造成細胞周期差異的主要原因。1、脈沖標記DNA復制和細胞分裂指數(shù)觀察測定法

3H-TdR標記，洗滌，培養(yǎng)，定時取樣，放射自顯影分析。

BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)可替代T。2、流式細胞分選儀檢測法根據(jù)DNA含量分類細胞，根據(jù)類群細胞的數(shù)量推斷時間。細胞周期各階段的時間(細胞周期測定)TG2－G2期時間，TM－M期時間，TS－S期時間，TC－細胞周期時間，TG1＝TC

－（TG2

＋TM＋

TS

）2、流式細胞分選儀檢測法

流式細胞儀（FlowCytometry）流式細胞儀的基本工作原理：

包在鞘液（包被細胞的液流）中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出的熒光和散射光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果。（將細胞某成分的熒光信號→電信號→疊加信號的圖形）流式細胞儀的主要應用：定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；

從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；

分離DNA含量不同的中期染色體。A.細胞周期中DNA含量變化；B.流式細胞儀檢測細胞周期根據(jù)DNA含量分類細胞，根據(jù)類群細胞的數(shù)量推斷時間。3、縮時攝像技術

可以得到準確的細胞周期時間及分裂間期和分裂期的準確時間。（三）根據(jù)增殖狀況，高等動物細胞分為三類有絲分裂周期G0G1G2SM（三）根據(jù)增殖狀況，高等動物細胞分為三類EmbryocellsCyclingcellsG0cellsTerminalcells各增殖類型的代表組織細胞·周期中細胞(cyclingcell)或連續(xù)分裂細胞：如表皮生發(fā)層細胞（basalcelllayer）

、部分骨髓細胞(bonemarrowstemcells)。

·終末分化細胞（Terminallydifferentiatedcells）：不分裂細胞，指不可逆地脫離細胞周期，不再分裂的細胞，又稱終端細胞，如神經、肌肉、多形核細胞等?！ば菝呒毎?G0期細胞，G0phasecell)：G0期多發(fā)生在G1期，如成纖維細胞、某些淋巴細胞、肝細胞、腎細胞等。G0期細胞和終末分化細胞的界限有時難以劃分，有的細胞過去認為屬于終末分化細胞，目前可能被認為是G0期細胞。（四）細胞周期中不同時相及其

主要事件◆G1期◆S期◆G2期◆M期1.G1stage（Thefirstgap,DNA合成前期）◆G1

期較其他時期長◆細胞體積增大細胞表面積∕體積之比變小;核∕質比變小◆合成各種糖類、RNA和蛋白質等

●合成各種RNA

Baserga(1956)用放線菌素D(ActinomycinD)作用于G1期的細胞，抑制RNA的合成，結果細胞就不能進入S期。●合成各種蛋白質：

G1期向S期轉變的pro:觸發(fā)蛋白、鈣調蛋白、細胞周期蛋白（觸發(fā)蛋白(triggerprotein)

：一類不穩(wěn)定蛋白質，只有當含量達到臨界值時，才可轉向DNA復制方向。鈣調蛋白：核內Ca2+受體，調節(jié)Ca2+濃度；在G1末達峰值，促進G1向S轉變。細胞周期蛋白(cyclin)：一類隨細胞周期的變化呈周期性的出現(xiàn)與消失的蛋白質，在細胞周期的不同階段表達，發(fā)揮不同的調控作用。它可以與細胞周期基因的產物（p34cdc2）結合并調節(jié)其活性，是MPF的調節(jié)亞基。）

Ieranlma和Yasukaw(1966)用蛋白質合成抑制劑抑制G1期細胞的蛋白質合成，細胞不能進入S期

合成與細胞生長、DNA復制有關的酶RNA聚合酶、DNA合成酶等◆蛋白質的磷酸化作用加強（與DNA合成啟動相關）

在蛋白激酶催化下，ATP或GTP的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基的過程，激活蛋白質的活性。

組蛋白（H1）、非組蛋白、激酶磷酸化◆膜轉運功能增加氨基酸、葡萄糖等進入細胞◆染色質去凝集◆

G1期的變化

增殖旺盛的細胞該期時間短，衰退細胞則時間長。衰老細胞停止于G1期。許多原生動物、真菌等沒有G1期。高等植物中，休眠期的種子大多處于G1期，由于所處生理條件的不同，G1期數(shù)天至數(shù)年，少數(shù)可停止在G2期。一般，不進行分裂或極少分裂的動物細胞停止在G1期。因接觸抑制(contactInhibition)而停止分裂的培養(yǎng)細胞也停止在G1期。G1期是為S期的DNA合成做準備2.S期（DNA合成期）◆脈沖標記實驗

◆S期持續(xù)時間不同

APULSE-LABELINGEXPERIMENT1.Feedradioactive

thymidine(T*)to

cellsgrowingin

culture.2.After30minutes,

washunincorporated

T*outofcellculture.3.Spreadoutcells

andlayx-rayfilm

overthem.

有絲分裂前

S期

蠑螈

12小時

小鼠

5～6小時

小麥

3.8小時

酵母

0.5小時ExperimentaldemonstrationofthecoordinatedSynthesisofDNAandhistones.◆DNA復制與組蛋白合成同步，組成核小體串珠結構核小體（nucleosome）：一種串珠狀結構。構成：200bpDNA、5種組蛋白核心：4種組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各2個分子組成八聚體核心顆粒；圓盤形相鄰核小體：H1組蛋白結合60bp連接DNAH1鎖住DNA分子進出口，穩(wěn)定結構組蛋白：與組裝構成染色質等有關

染色質的基本結構單位——核小體(nucleosome)

鋪展染色質的電鏡觀察

未經處理的染色質自然結構為30nm的纖絲，經鹽溶液處理后解聚的染色質呈現(xiàn)10nm串珠狀結構

核小體的性質及結構要點示意圖（引自B.Alberts等）

在用微球菌核酸酶降解染色質時，反應早期可得到166bp的片段，但不穩(wěn)定；進一步降解則得到146bp片段，比較穩(wěn)定。推測可能原因是失去H1后，DNA兩端各有10bp的DNA，易被核酸酶作用而降解。多級螺旋模型核小體10nm纖維30nm纖維螺線管◆中心粒復制中心粒的發(fā)育過程（中心體周期）

微管（microtubule）的結構組成與極性MT可裝配成單管,二聯(lián)管(纖毛和鞭毛中),三聯(lián)管(中心粒和基體中)。Arrangementofprotofilamentsinsinglet,double,andtripletMTsSingletDoubleTripletABABCInciliaandflagellaIncentriolesandbasalbodiesMT的成分-tubulin（微管蛋白）和-tubulin聚合，形成異二聚體微管蛋白上有（1）GTP結合位點：與α微管蛋白GTP結合位點結合的GTP不發(fā)生水解或交換，稱為不可交換位點（nonexchangeablesite,Nsite）。微管組裝時與β微管蛋白結合的GTP可發(fā)生水解，去組裝后結合的GDP可交換為GTP，故稱為可交換位點（nexchangeablesite,Esite）。（2）二價陽離子結合位點。（3）秋水仙素結合位點。（4）長春花堿結合位點。異二聚體組裝，形成原纖維；13條原纖維，形成一根微管；有極性（即頭尾）,頭（－極），尾（

＋極）作用于微管的特異性藥物

秋水仙素(colchicine)：與-tubulin肽鏈中第201位Cys（胱氨酸）結合，阻斷微管蛋白組裝成微管，可破壞紡錘體結構。紫杉酚(taxol)能促進微管的裝配,并使已形成的微管穩(wěn)定。但這種穩(wěn)定對細胞是有害的，使細胞停止于有絲分裂期?！糁行牧椭浦行牧５陌l(fā)育過程（中心體周期）

微管組織中心：在活細胞內，能夠起始微管的成核作用并使之延伸的細胞結構稱為微管組織中心（microtubuleorganizingcenter，MTOC）。微管組織中心決定了細胞中微管的極性，微管的負極指向微管組織中心，正極背向微管組織中心。如動物細胞中的中心體(centrosome),也存在于低等植物細胞（如衣藻、團藻等藻類植物），高等植物細胞無中心體。中心體(centrosome)中心粒（centrioles）：位于紡錘體兩端，由9組三聯(lián)管構成中心體(centrosome)：由一對相互垂直的中心粒及周圍基質構成。

γ管蛋白：位于中心體周圍的基質中，環(huán)形結構，結構穩(wěn)定，為αβ微管蛋白二聚體提供起始裝配位點，所以又叫成核位點

·中心粒(centrioles)結構

·中心粒復制周期

結構:9組微管三聯(lián)體，中心體具有9（3）＋2結構

a:中心體及周圍物質（PCM);b:9組微管三聯(lián)體呈風車狀排列;c:兩對中心體；d:微管在MTOC上的聚合

γ管蛋白：位于中心體周圍的基質中，環(huán)形結構，結構穩(wěn)定，為αβ微管蛋白二聚體提供起始裝配位點，所以又叫成核位點γ管蛋白成核位點成核模型及微管組裝◆中心粒復制中心粒的發(fā)育過程（中心體周期）中心粒在G1中期以后開始分開。中心粒在S期復制：兩個中心粒各產生了一個新的中心粒。中心體在G2晚期至M早期（前期），長大并向細胞兩極移動。中心體（Centrosome）存在于低等植物細胞（如衣藻、團藻等藻類植物）和動物細胞中

◆DNA復制不同步，早期GC合成較多，晚期AT合成較多；常染色質復制較早，異染色質復制較晚；復制以多個復制子進行◆此期遺傳物質較易受損，因為DNA在合成過程中核苷酸雙鏈分開，易受致突變致癌物的影響?！粲肈NA合成抑制劑處理，細胞將停留在S期。G2期◆細胞繼續(xù)長大◆DNA復制完成(2n→4n)◆在G2期合成一定數(shù)量的蛋白質和RNA分子◆中心體在G2期長大，G2晚期開始向細胞兩極移動◆合成微管蛋白等,為M期紡錘體準備◆G2期DNA已經加倍，對環(huán)境較敏感，容易受溫度、pH等的影響而停滯，當這些因素去除后能恢復。增殖型腫瘤細胞若在G2期，宜用放療?！鬐2期的持續(xù)時間較短。M期

◆M期即細胞分裂期，真核細胞的細胞分裂主要包括兩種方式，即有絲分裂(mitosis)和減數(shù)分裂(meiosis)。遺傳物質和細胞內其他物質分配給子細胞?！羧旧|凝集，紡錘體形成，收縮環(huán)出現(xiàn)，

遺傳物質和細胞內其他物質分配給子細胞

◆M期的持續(xù)時間較短?！ohnson和

Rao(1970)將人HelaM期細胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細胞融合誘導間期細胞的染色體發(fā)生凝縮(早熟凝集染色體PCC)：

G1期PCC為單線狀，因DNA未復制；S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復制；G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復制已完成。提示M期細胞存在誘導PCC的因子稱成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF)。MPF促進間期細胞分裂不同形態(tài)的PCC（五）細胞周期檢驗點(checkpoint)細胞周期檢驗點：是存在于細胞周期G1、M、G2時相中調控細胞周期運行的特殊時期。主要是確保周期每一時相事件的有序、全部完成，并與外界因素（營養(yǎng)和激素等）和內在因素（細胞分裂周期基因cdc）相聯(lián)系。

.

◆G1期檢驗點：酵母——Start；動物細胞——RestrictionPoint

，R點控制G1進入DNA合成期，相關的事件包括：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境如營養(yǎng)、細胞生長因子等是否適宜？細胞體積是否

足夠大等？

細胞所得養(yǎng)分不足時：→G1→→G0人體正常器官、組織的細胞周期進程中,若發(fā)生R點的消失，自分泌大量生長因子等異常情況時，其生長、分裂將失去控制，由此形成贅生物如腫瘤?！鬝期檢驗點：DNA復制是否完成？◆G2期檢驗點：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？◆M期檢驗點（中-后期檢驗點，紡錘體組裝檢驗點）：紡錘體是否形成？著絲點是否正確連接到紡錘體上？染色體是否完好？

(六）細胞周期同步化細胞周期同步化(synchronization)是指在自然過程中發(fā)生或經人為處理造成的細胞周期同步化，前者稱自然同步化，后者稱為人工同步化。細胞周期的同步化只是暫時性的，經過幾代分裂之后，細胞群又會處于周期不同步狀態(tài)。1、自然同步化，◆多核體：如某種粘菌的變形體（plasmodia）只進行核分裂，而不發(fā)生胞質分裂，形成多核體。數(shù)量眾多的核處于同一細胞質中，進行同步化分裂，使細胞核達108，體積達6~9cm?！裟承﹦游锸芫言缙诼蚜袴ruitflyembryo◆某些水生動物的受精卵：如海膽卵可以同時授精，最初的3次細胞分裂是同步的，再如大量海參卵受精后，前9次細胞分裂都是同步化進行的?！粼鲋骋种平獬蟮耐椒至眩喝缯婢男菝哝咦右迫脒m宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。2、人工同步化（1）人工選擇同步化：◆有絲分裂選擇法：使單層培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)增殖期，此時分裂活躍。有絲分裂細胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低，此時輕輕振蕩，M期細胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，收集培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依法繼續(xù)收集，則可獲得一定數(shù)量的中期細胞。其優(yōu)點是，操作簡單，同步化程度高，細胞不受藥物傷害，缺點是獲得的細胞數(shù)量較少。（分裂細胞約占1%～2%）◆細胞沉降分離法：不同時期的細胞體積不同，而細胞在給定離心場中沉降的速度與其半徑的平方成正比，因此可用離心的方法分離。其優(yōu)點是可用于任何懸浮培養(yǎng)的細胞，方法簡單省時，效率高，成本低。，缺點是同步化程度較低，對大多數(shù)種類的細胞并不適用。

常用密度梯度離心法（densitygradientcentrifugation）：根據(jù)不同時期的細胞在體積和重量上存在差別進行分離。如混合細胞懸液經蔗糖密度梯度離心后，小細胞集中在蔗糖梯度的頂部，搜集起來便可進行同步培養(yǎng)。酵母和哺乳動物細胞培養(yǎng)物可用此法同步化分選。差速離心密度梯度離心（2）藥物誘導同步化◆DNA合成陰斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成，而不影響其他時期細胞的運轉，最終可將細胞群阻斷在S期或G/S交界處。5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使細胞同步化。其中高濃度TdR對S期細胞的毒性較小，因此常用TDR雙阻斷法誘導細胞同步化。優(yōu)點是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系?？蓪缀跛械募毎交?。缺點是產生非均衡生長，個別細胞體積增大。TdR阻斷法進行細胞同步化◆中期阻斷法：利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較少。優(yōu)點是無非均衡生長現(xiàn)象，缺點是可逆性較差。3、其他同步化方法◆血清饑餓法、異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法等，可獲得大量處于G1期的細胞?！?/p>

溫度

分裂前細胞的一些酶對溫度非常敏感，高溫可使分裂停止，而生物合成繼續(xù)進行，因此有些細胞發(fā)生分裂的時間推遲，其他后進的細胞便趁此趕上來，達到同步化狀態(tài)。Zeutnen和Scherbaum(1954)發(fā)現(xiàn)，將四膜蟲(retrahymena)在29.5℃（最適溫度）與34℃（抑制溫度）兩種溫度下每半小時進行交替培養(yǎng)，經7次循環(huán)之后，再于24℃下培養(yǎng)，結果有85%的細胞發(fā)生了同步分裂?！糨椛浞至亚暗募毎麑ι渚€很敏感，輻射可使細胞在分裂前積累，隨后去除輻射，細胞便在同一時間開始分裂?！魲l件依賴性突變株在細胞周期同步化中的應用：將與細胞周期調控有關的條件依賴性突變株轉移到限定條件下培養(yǎng)，所有細胞便被同步化在細胞周期中某一特定時期。（七）特異的細胞周期

特異的細胞周期是指那些特殊的細胞所具有的與標準的細胞周期相比有著鮮明特點的細胞周期。◆爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期◆酵母細胞的細胞周期◆植物細胞的細胞周期◆細菌的細胞周期1、爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期·細胞分裂快,幾乎無G1期和G2期，S期也短(所有復制子都激活),以至認為僅含有S期和