基因克隆操作過(guò)程教學(xué)課件

基因克隆操作過(guò)程概述1DNA的體外重組—酶切◎◎和連接(切、接)載體外源重組DNA分子DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染2重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)細(xì)菌增(轉(zhuǎn)、增)重組DNA增殖甲囊3轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定(檢)體培養(yǎng)∵::篩選含重組質(zhì)粒的細(xì)菌2011-10-23基因克隆操restrictionendonucleaseDNAligase切接轉(zhuǎn)增校88目88、DNA的體外重組(切與接)011-10-23基因克隆操作過(guò)程1DNA的體外重組(一)—切工具:限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)作用對(duì)象:目的基因片段、載體·目的:獲得具有互補(bǔ)粘性末端(或平末端)的線(xiàn)性目的基因片段和線(xiàn)性化載體88睡882011-10-23HindⅢECOR■識(shí)別位點(diǎn)GAATTCCTTAAG■制品內(nèi)容8-20U(商度二附帶緩沖液Pvu‖lCAGCTG反應(yīng)停止液10xLoadingButterGTCGAC反應(yīng)溫烹■制品內(nèi)容[濃巴8~20U(高濃度30~60U附級(jí)沖液反應(yīng)碳中2011-10-23基因克隆操作過(guò)各種限制酶酶切反應(yīng)所使用的buffer(Takara)雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer(TakaraEnzymeAccIBamHIBgllClaIEcoRIEcoRVHin1xM05×K1×T1xM1×M|05×K1×MBamH10.5xK1×K1xK1xK1xK1xK0.5×KBgll1xT1×K1×H1×H1×H1xH2×KEcoRI1×M1×K1×H1×H1×H1×H1×M2011-10-23基ECORV0.5×K(1×KH1×H1xH2×THinc1×M05×K2×K1×M1xM2×T1×M單酶切實(shí)例(Takara)4.oryzaerIB40-amdS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的ho單酶切分析1.Oryzaerib40-amds序列的限制性?xún)?nèi)切酶酶譜分析限制性?xún)?nèi)切酶所需bue特征序列。酶切位點(diǎn)l10×HCTCGAG.1655bp2.酶切樣品:2007-6-4Horaerib40-amdSPCR產(chǎn)物的凝膠回收純化樣品3.OryzaeRIB40-andS基因PCR-oI單酶切體系(10y)組分所需體系山)備注ddH,>24forgerib40-and基因PCR純化樣品6010xHbuffer1.0(8U/)A7oI06用量不超過(guò)體系體積的10%4.酶切條件:各組分混勻后,封口膜封口,37℃保淵過(guò)夜進(jìn)行醇切(水浴為佳)5.酶切時(shí)間:2007-6-418:002007-6-510:002011-10-23基因克隆操作過(guò)程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例(Takara)pPMA19質(zhì)粒因的酶切分析1酶切方案設(shè)計(jì)(1)pMA質(zhì)粒上的Bamo位點(diǎn)分析(如圖)①BmH:2個(gè)②oI:1個(gè)(2)酶切結(jié)果分析pPMA質(zhì)粒經(jīng)BM+o雙酶切應(yīng)得到三個(gè)片段:200p、990bp、4032bp。2酶切體系及條件(1)酶切體系(20p)pPMA-BamHI+A7o雙酶切組分體積(山)。備注IdhopPMA質(zhì)粒。8.010×Buffer15Uu)BmH(30℃)不超過(guò)體系體積的10%8Ujul)al(37℃)(2)酶切反應(yīng)條件:各組分混勻后,封口膜封口,34℃保溫過(guò)夜進(jìn)行酶切(水浴為佳)011-10-23基因克隆操作過(guò)程2.DNA的體外重組(二)—接工具:DNA連接酶(DNAligase)作用對(duì)象:具有互補(bǔ)粘性末端(或平末端)的線(xiàn)性目的基因片段和線(xiàn)性化載體目的:獲得含有目的基因的環(huán)狀載體88睡882011-10-23(1)單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGEcoRI5AATTCG5AATTCCTTAA5′GCTTAA5退火GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGa)獲得連接方GAATTCGAATTC向不同的兩種CTTAACTTAAG產(chǎn)物;T4-DNAligase