基因組測(cè)序的原理與方法課件

大規(guī)模基因組測(cè)序的

原理與方法1ppt課件.

元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ)元素周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！

“基因組”----生命科學(xué)的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)2ppt課件.基因組學(xué)的基礎(chǔ)理論研究基因組學(xué)是要揭示下述四種整合體系的相互關(guān)系:基因組作為信息載體

（堿基對(duì)、重復(fù)序列的整體守恒與局部不平衡的關(guān)系）基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體

(基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學(xué)機(jī)制的關(guān)系)基因組作為生物化學(xué)分子的整合體

(基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系）物種進(jìn)化的整合體

(物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇）3ppt課件.

基因組學(xué)是一個(gè)大學(xué)科“界門綱目科屬種”，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個(gè)基因組?；蚪M作為信息載體，它所儲(chǔ)存的信息是最基本的生物學(xué)信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點(diǎn)之一，又是生物信息的歸宿?；蚪M學(xué)研究包括對(duì)基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學(xué)研究?；蚨鄳B(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究?；蚪M學(xué)的研究必然要上升到細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)制和系統(tǒng)生物學(xué)的水平?；蚪M的起源與進(jìn)化和物種的起源與進(jìn)化一樣是一個(gè)新的科學(xué)領(lǐng)域?；蚪M信息正在以天文數(shù)字計(jì)算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個(gè)嶄新的學(xué)科。4ppt課件.

基因組學(xué)是一門大科學(xué)基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律和相互關(guān)系?；蚪M的信息含量高?；蚪M學(xué)的研究又在于基因組間的比較?；蚪M學(xué)的復(fù)雜性必然導(dǎo)致多學(xué)科的引進(jìn)和介入（各生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)等）?；蚪M學(xué)研究的手段和技術(shù)已經(jīng)走在生命科學(xué)研究的最前沿?；蚪M信息來自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。人類基因組計(jì)劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。5ppt課件.基因組與生命之謎基因組的產(chǎn)生與進(jìn)化。基因組DNA組分的變化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)化。內(nèi)含子（尤其是大于100，000核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運(yùn)輸和降解。最小內(nèi)含子的生物學(xué)意義。動(dòng)物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個(gè)性。物種衍變過程中基因組水平的變化?；蚪M大小變化與遺傳、分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系。“JUNKDNA”的發(fā)生、分類、進(jìn)化與功能。6ppt課件.

大規(guī)?；蚪M測(cè)序漸入佳境三十億三年內(nèi)完成：繼酵母、線蟲、果蠅、擬南芥后，是人、斑馬魚、水稻和小鼠的基因組。三百億計(jì)劃已在執(zhí)行：大鼠、豬、黑猩猩、狒狒、雞、牛、小麥、玉米、大麥、大豆、棉花、各種人畜寄生蟲和幾百種人、動(dòng)物和植物的病原微生物。三千億勢(shì)在必行。將涉及家畜、家禽、樹木、海洋生物、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴锏人写砦锓N。7ppt課件.

大規(guī)模和高速度的重要性測(cè)定一個(gè)哺乳動(dòng)物基因組30億堿基對(duì)相當(dāng)于6千萬測(cè)序道（每道500核苷酸）相當(dāng)于300臺(tái)毛細(xì)管電泳儀全負(fù)荷運(yùn)行一年測(cè)定一個(gè)細(xì)菌基因組5百萬堿基對(duì)相當(dāng)于十萬測(cè)序道相當(dāng)于180臺(tái)機(jī)器/天知識(shí)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)為出發(fā)點(diǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的占有者對(duì)后來者的制約8ppt課件.基因組學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的接軌“海量”（>1010)基因組信息的收集、管理和分析科學(xué)文獻(xiàn)、組織與發(fā)育的三維解剖圖像、生物分子的分類和相關(guān)性等的高速檢索（>1014)多維生物分子結(jié)構(gòu)的運(yùn)算和預(yù)測(cè)（>1022)生物分子之間的相互作用(信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)傳導(dǎo)、大腦功能模擬、細(xì)胞機(jī)制模擬等)（>1030)計(jì)算生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究的未來(>1050)9ppt課件.世界大型基因組研究中心美國：1)NationalHumanGenomeResearchInstitutioninNIH 2)GenomeCenteratWhiteHead/MIT 3)WashingtonUniversityGenomeCenter 4)JointGenomeInstitutionatDOE 5)GenomeCenteratBaylorMedicalCollage

英國：Sanger

Center日本：RIKEN中國：華大基因研究中心（北京、杭州）

國家人類基因組中心（北京、上海）

10ppt課件.大規(guī)?；蚪M測(cè)序的幾個(gè)支撐技術(shù)

Sanger雙脫氧末端終止法

PCR技術(shù)

DNA自動(dòng)測(cè)序儀的發(fā)展生物信息學(xué)分析軟硬件設(shè)施11ppt課件.“雙脫氧末端終止”的含義12ppt課件.

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）原理反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液每個(gè)循環(huán)包括：變性（90℃）、退火（54℃）、延伸（72℃）13ppt課件.Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)序原理14ppt課件.DNA自動(dòng)測(cè)序儀的發(fā)展

自動(dòng)熒光毛細(xì)管凝膠電泳測(cè)序儀代表：安瑪西亞公司MegaBACE1000

96個(gè)電泳讀長高達(dá)500-600bp

日分析能力達(dá)1000個(gè)樣品自動(dòng)熒光垂直板凝膠電泳測(cè)序儀

代表：ABI公司377型垂直板自動(dòng)測(cè)序儀

96個(gè)泳道讀長高達(dá)700-800bp

日分析能力達(dá)300個(gè)樣品

電泳，看誰跑得快熒光檢測(cè)探頭

短片段先檢測(cè)到長片段后檢測(cè)到15ppt課件.大規(guī)?；蚪M測(cè)序的兩種策略逐步克隆法（ClonebyClone）全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)16ppt課件.………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC或contig用于霰彈法測(cè)序的候選克隆用于霰彈法測(cè)序的亞克隆測(cè)序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測(cè)序并進(jìn)行全基因組序列組裝完整的基因組序列17ppt課件.

兩種大規(guī)模基因組測(cè)序策略的比較

項(xiàng)目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費(fèi)用低高計(jì)算機(jī)性能高（以全基因組為單位進(jìn)行拼接）低（以BAC為單位進(jìn)行拼接）適用范圍工作框架圖精細(xì)圖代表測(cè)序物種果蠅、水稻人、線蟲18ppt課件.BACbyBACWholeGenomeShotgun…thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtocompletionbythemethodsdescribedinthisissue.

19ppt課件.“WorkingDraft”(90%;4X)FinishedGenome(99.99%;8X)Gap1Gap2Chromosome工作草稿（框架圖）與完成圖20ppt課件.人類基因組計(jì)劃研究的主要成果和進(jìn)展表現(xiàn)在這“四張圖”遺傳圖譜又稱為連鎖圖譜（linkagemap），指基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離物理圖譜

以定位的DNA標(biāo)記序列如STS作為路標(biāo)，以DNA實(shí)際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。轉(zhuǎn)錄圖譜

利用EST（expressedsequencetags

表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜序列圖譜通過基因組測(cè)序得到的，以A、T、G、C為標(biāo)記單位的基因組DNA序列

21ppt課件.逐步克隆法（ClonebyClone)物理圖譜的構(gòu)建大片段克隆的篩選霰彈法測(cè)序與“工作框架圖”的構(gòu)建序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建22ppt課件.物理圖譜的制作

23ppt課件.物理圖譜的制作——序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖

物理圖譜是以特異的DNA序列為標(biāo)志所展示的染色體圖。標(biāo)志之間的距離或圖距以物理距離如堿基對(duì)（basepair；bp，Kb,Mb)表示。最精細(xì)的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。

STS圖譜是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一，STS（SequenceTaggedSite)本身是隨機(jī)地從人類基因組上選擇出來的長度在200～300bp左右的特異性短序列（每個(gè)STS在基因組中是唯一的，STS圖譜就是以STS為路標(biāo)（平均每100Kb一個(gè)），將DNA克隆片段有序地定位到基因組上。STS的來源隨機(jī)基因組序列表達(dá)基因序列，如EST遺傳標(biāo)記序列，如微衛(wèi)星標(biāo)記有關(guān)STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫GDB中找到http://gdbwww.gdb.org24ppt課件.物理圖譜構(gòu)建的步驟確定各STS序列及其在基因組中的位置大插入片段基因組文庫的構(gòu)建（BAC文庫）以特定STS為標(biāo)記篩選并定位克隆含有STS的克隆在基因組中排序基因組數(shù)據(jù)庫（GDB）中至少含有24568個(gè)STS路標(biāo)信息

25ppt課件.關(guān)于文庫作為載體的基本要求

能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制具有多克隆位點(diǎn)，可插入外源DNA片段有合適的篩選標(biāo)記，如抗藥性大小合適，易于分離純化拷貝數(shù)多

文庫的概念

含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體載體：能攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具，常用的載體有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、細(xì)菌人工染色體等宿主：能容納外源DNA片段的生物體，常用的有大腸桿菌、酵母等26ppt課件.BAC文庫的構(gòu)建NotI、SacI脈沖場(chǎng)凝膠電泳得200Kb左右的大片段DNA

純化后與載體連接

電轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞插有外源DNA片段的BAC載體在含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆27ppt課件.BAC克隆的篩選“STS-PCR反應(yīng)池”方案篩選種子克隆特定的STS標(biāo)記

相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成重疊群

，并定位于基因組上Contig每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆28ppt課件.29ppt課件.共48個(gè)每組8個(gè)每8個(gè)96孔板組成1個(gè)superpool，384個(gè)96孔板組成48個(gè)superpools

48superpools30ppt課件.

Columnpools

Rowpools

123456789101112第八板第二板Platepools第一板

platepools，rowpools，columnpools的構(gòu)成

31ppt課件.“STS-PCR反應(yīng)池”方案（PoolingProtocol）

1234567891011

12超級(jí)池（8個(gè)96孔板，共768個(gè)克隆）板池（96個(gè)克?。┬谐兀?2個(gè)克隆）列池（8個(gè)克?。┐蟠鬁p少篩選的工作量，降低成本，所得篩選結(jié)果準(zhǔn)確可靠

28VS76832ppt課件.sheetofsuperpools,platepools,rowpools,columnpools

33ppt課件.

一BACScreening前48個(gè)樣品為引物OGG1.51對(duì)superpool(sp)的篩選結(jié)果后48個(gè)樣品為引物OGG1.52對(duì)superpool(sp)的篩選結(jié)果

34ppt課件.引物OGG1.52對(duì)應(yīng)sp#27,34,45的plate,row,columnpools的篩選結(jié)果35ppt課件.BACclone確定

(+為陽性克隆)

36ppt課件.引物OGG1.52的Colony-PCR

37ppt課件.延伸克隆的篩選

STS的密度尚未達(dá)到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成很多區(qū)域沒有陽性克隆覆蓋,形成空洞。因此需用指紋圖譜（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence)步移等手段對(duì)種子克隆進(jìn)行延伸，形成連續(xù)克隆群。利用延伸方法篩選得到的克隆稱為延伸克隆。

Contig1Contig2重疊序列重疊序列延伸引物篩選到的延伸克隆38ppt課件.>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlaneBACclones在96深孔板中培養(yǎng)-HindIII完全酶切-1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達(dá)到延伸目的。39ppt課件.末端序列步行法（WalkingbyEndSequence）

挑取靠近空洞的種子克隆進(jìn)行末端測(cè)序，然后在基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確定專一性的序列片段作為新的STS路標(biāo)。最后設(shè)計(jì)新路標(biāo)的PCR引物，按照STS—PCR“反應(yīng)池”方案篩選新的克隆，達(dá)到延伸的目的?？寺?50A18序列輸入endsequencedatabase的查詢結(jié)果40ppt課件.四、CloneIdentification1、STS-PCR2、BACendsequencing3、Fingerprinting4、FISH

41ppt課件.CK2CK1CK2CK113f06267l16481o07250a15204c23340j13對(duì)15個(gè)克隆進(jìn)行HindIII酶切后電泳結(jié)果

42ppt課件.43ppt課件.“工作框架圖”繪制根據(jù)序列與STSdatabase進(jìn)行blastn比較結(jié)果，將克隆定位末端序的比較，判定延伸在contig外的一端序列。并可及時(shí)進(jìn)行walking，篩選新的克隆

44ppt課件.霰彈法測(cè)序組裝與Finishing45ppt課件.SequenceDataDistributionVector大規(guī)?；蚪M測(cè)序中的信息分析BasecallingRepeatMarkORFPredictionGeneAnnotationFinishingAssembleVectorMarkPhredPhd2fastaCrossmatchPhrapConsedRepeatmaskerGlimmerBlastxBlastnClastaltRNAscanQualityControlQualCalQualDrawQualStatCOGsSwiss-port,PIR,GDB,GenBankSequencing46ppt課件.ShotgunSequencingI:RANDOMPHASEBacClone:100-200kbShearedDNA:1.0-2.0kbSequencingTemplates:RandomReads47ppt課件.ShotgunSequencingII:ASSEMBLYConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)48ppt課件.ShotgunSequencingIII:FINISHINGHighAccuracySequence:<1error/10,000bases49ppt課件.Assembly基本軟件：phrap功能：對(duì)所有的reads根據(jù)它們的序列文件和質(zhì)量文件比較各個(gè)reads之間的重疊部分

，對(duì)最有可能連接的reads進(jìn)行拼接，產(chǎn)生.seq.screen.contigs和.seq.screen.singlets以及phrap.out文件。50ppt課件.Consed軟件顯示序列組裝結(jié)果界面

1、Filling“intraclonegaps”51ppt課件.

SequencedcloneBACselectedby

end-sequence113L10324K11173F11101A4167P17586C2116K5572B22544N5R-155E142006P232306M15R-149E1560K?Gapfillingbyendsequences2、Filling“interclonegaps”52ppt課件.克隆211B19組裝后的序列的錯(cuò)誤率為零

53ppt課件.WGS的三個(gè)階段GenomeSurvey（GS）

1－2測(cè)序覆蓋度WorkingDraft(WD)：（90％以上的功能區(qū)域覆蓋度）

3－4測(cè)序覆蓋度GenomeCompletion(GC):(99％以上的功能區(qū)域覆蓋度) 6測(cè)序覆蓋度以上54ppt課件.Finishing軟件：consed功能：讀取phrap產(chǎn)生的<project>.ace文件，可以直觀的看到所有的contig的拼接情況，讓人可以根據(jù)情況改變拼接質(zhì)量，設(shè)計(jì)引物來彌補(bǔ)gap。55ppt課件.術(shù)語鳥槍法測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝鳥槍法文庫：目標(biāo)基因組一定長度隨機(jī)片段克隆的集合。正反向測(cè)序?qū)Γ簭耐粋€(gè)克隆片段兩端分別測(cè)序所得到的一對(duì)序列。.插入片段長度：克隆載體中插入的外源DNA片段長度。片段連接群(contig)：用識(shí)別互相重疊的方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接的結(jié)果。.Scaffold:用正反向測(cè)序?qū)B接的非重疊片段連接群。LW-洞：由于沒有測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋而在組裝結(jié)果中留下的洞。56ppt課件.重復(fù)序列分析覆蓋度：基因組被測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋的次數(shù)。重復(fù)數(shù)：一段DNA序列在基因組中出現(xiàn)的次數(shù)。深度：一段DNA序列在鳥槍法測(cè)序數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)次數(shù)。例如一個(gè)轉(zhuǎn)座子在基因組中出現(xiàn)N次，測(cè)序數(shù)據(jù)集的覆蓋度為C,則這個(gè)轉(zhuǎn)座子的平均深度為NC。20-mer重復(fù)序列：任何深度超過為該數(shù)據(jù)集確定的重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)的20-bpDNA片段。是數(shù)學(xué)定義的重復(fù)序列。重復(fù)序列洞：由于屏蔽重復(fù)序列而在組裝結(jié)果中留下的洞。57ppt課件.組裝結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)N50大?。喊呀M裝出的contigs或scaffolds從大到小排列，當(dāng)其累計(jì)長度剛剛超過全部組裝序列總長度一半時(shí)，最后一個(gè)contig或scaffold的大小。單堿基錯(cuò)誤率：與參考序列比較后發(fā)現(xiàn)的小尺度上的不同所占的比例。所謂小尺度，在這里通常指小于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序長度，即500bp。實(shí)際上常常只是幾個(gè)堿基。錯(cuò)誤組裝的Contig：測(cè)序數(shù)據(jù)組裝中出現(xiàn)的錯(cuò)誤。由定義，它涉及的片段一般大于500-bp。包括與參考序列相比，插入、刪除，以及在方向和次序上不同的片段。錯(cuò)誤組裝的Scaffold：把非重疊contig連接在一起時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤。包括嵌套，錯(cuò)誤的方向和順序等。58ppt課件.TheFlowChartofRePS59ppt課件.重復(fù)序列的檢測(cè)與處理60ppt課件.插入片段大小引起的錯(cuò)誤組裝61ppt課件.RePS2的新流程圖62ppt課件.果蠅組裝軟件（2000）特點(diǎn)：組裝前數(shù)據(jù)預(yù)處理；用數(shù)據(jù)庫屏蔽重復(fù)序列；采用類似BLAST的方法找出重疊部分；選擇不沖突的重疊構(gòu)建contigs，識(shí)別重復(fù)序列邊界；用正反向信息構(gòu)建scaffolds，填洞。使用情況：用于果蠅基因組組裝。63ppt課件.用于人類基因組組裝時(shí)的改進(jìn)（2001）構(gòu)建contigs后，利用一個(gè)統(tǒng)計(jì)模型識(shí)別低拷貝重復(fù)序列；采用兩種方式利用已公布的人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)，即

1.把人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)分解成“人工reads”，進(jìn)行組裝；

2.利用人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)的定位對(duì)shotgun數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，然后組裝。64ppt課件.ARACHNE（2002）特點(diǎn)：組裝前通過多序列比對(duì)糾正測(cè)序錯(cuò)誤；考慮質(zhì)量數(shù)據(jù)，對(duì)每對(duì)重疊reads打分；通過分析reads重疊情況識(shí)別重復(fù)序列的邊界，組裝的contigs避免越過邊界；識(shí)別重復(fù)序列contigs；構(gòu)建scaffolds，填補(bǔ)空洞。使用情況：使用數(shù)個(gè)物種，包括人21、22染色體數(shù)據(jù)進(jìn)行了檢驗(yàn)。65ppt課件.ThePhusionAssembler（2003）特點(diǎn)：輸入數(shù)據(jù)包括正反向信息，插入片段長度在2-200kb之間；組裝前先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，然后并行處理；使用phrap進(jìn)行組裝，組裝過程中利用正反向信息對(duì)contig進(jìn)行延伸或打斷；根據(jù)重疊合并contigs；利用正反向信息構(gòu)建scaffolds。使用情況：用于小鼠基因組，7.5x，2.6Gb，479scaffolds66ppt課件.基因預(yù)測(cè)軟件介紹基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和模式識(shí)別的算法和軟件GRAIL（）GeneParser（/~eesnyder/GeneParser.html）GENEIDhttp://www1.imim.es/software/geneid/index.html基于語言學(xué)方法Genlang/genlang/genlang_home.html基于隱含馬爾可夫模型Genie/~dkulp/cgi-bin/genie）HMMgenehttp://WWW.cbs.dtudk/services/HMMgene/）GeneFinder軟件由美國華盛頓大學(xué)的ColinWilson，LaDeanaHilyer,和PhilGreen研發(fā)GENSCAN軟件由斯坦福大學(xué)數(shù)學(xué)系ChrisBurge和SamuelKarlin所研發(fā)67ppt課件.比較基因組研究“近親”的物種之間的差異非常小，有些在基因組序列水平的相似性就高達(dá)90％以上。但盡管如此，那些不足10％的序列差異卻導(dǎo)致了它們之間的很多本質(zhì)的變化，如種屬的差異或致病性的有無等等。因此，對(duì)它們進(jìn)行比較基因組的研究可能可以為人們理解物種間差異的本質(zhì)、基因的橫向轉(zhuǎn)移在進(jìn)化中的作用和特定微生物致病的機(jī)制等提供一條捷徑。例如，威斯康星基因組中心通過對(duì)大腸桿菌的致病株O157:H7株和非致病株K-12株進(jìn)行基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，它們之間共有了一個(gè)約4.1Mbp的高度同源且?guī)缀蹙€性一致的“主干”基因組序列（只在復(fù)制的終止點(diǎn)附近出現(xiàn)了一個(gè)約422Kbp的倒置），而這個(gè)主干序列則被幾百個(gè)具有株特異性（stain-specific）的片斷序列所“切斷”,并且在O157:H7株的這些特異性的序列片斷中，他們發(fā)現(xiàn)了很多可能的毒力相關(guān)的基因和一些前噬菌體的基因等，從而為研究O157:H7株的致病性機(jī)理提供了很大的幫助.68ppt課件.大規(guī)?；蚪M測(cè)序平臺(tái)逐步實(shí)現(xiàn)生物資源的“信息化、產(chǎn)權(quán)化、產(chǎn)業(yè)化”的基本支持利用我國有限的、可專利的生物資源的根本保障69ppt課件.70ppt課件.測(cè)序能力的“三級(jí)跳”人類基因組計(jì)劃1%項(xiàng)目的finishing(1999年)中-丹合作的家豬基因組計(jì)劃(2000年)水稻工作框架圖的繪制和公布(2001年)標(biāo)志著我國已掌握了國際先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，具有相當(dāng)?shù)臏y(cè)序能力。測(cè)序能力和質(zhì)量已達(dá)到國際一流水平,以獨(dú)立承擔(dān)大規(guī)模的基因組測(cè)序項(xiàng)目我國已經(jīng)成為繼美國之后世界上第二個(gè)具有獨(dú)立完成大規(guī)模的全基因組測(cè)序和組裝分析能力的國家71ppt課件.大規(guī)模、低成本已形成了一條世界第六、亞洲最大的基因組測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，共有MegaBACE測(cè)序儀104臺(tái)，ABI3730測(cè)序儀2臺(tái)，ABI377測(cè)序儀11臺(tái)，滿負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)日產(chǎn)可達(dá)50Mb，是一個(gè)低投入、高產(chǎn)出，高度自動(dòng)化的測(cè)序平臺(tái)。72ppt課件.測(cè)序平臺(tái)的構(gòu)成

73ppt課件.

大規(guī)模測(cè)序平臺(tái)的構(gòu)成

文庫組培養(yǎng)組模板組電泳組反應(yīng)組

MegaBACE

上機(jī)組數(shù)據(jù)處理組

基因組隨機(jī)文庫的構(gòu)建

測(cè)序模板的制備

測(cè)序反應(yīng)與純化反應(yīng)產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序

序列數(shù)據(jù)的接收、質(zhì)量評(píng)估、組裝等

含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌培養(yǎng)檢測(cè)模板質(zhì)量與測(cè)序定量74ppt課件.文庫組各種物種DNA的提取載體的制備大片段文庫(BAC、Cosmid)的構(gòu)建霰彈法文庫(pUC18)的構(gòu)建文庫質(zhì)量的檢測(cè)轉(zhuǎn)化文庫的保存75ppt課件.霰彈法文庫與BAC文庫的區(qū)別

項(xiàng)目

兩種文庫BAC文庫霰彈法文庫文庫的直接用途大片段DNA在基因組上定位測(cè)序基因組片段化的方法NotI/SacI不完全消化酶切超聲波打斷插入的DNA片段長度大100～300Kb小2～3Kb載體細(xì)菌人工染色體Bac質(zhì)粒載體pUC18

76ppt課件.霰彈法文庫構(gòu)建過程

超聲：打斷基因組DNA，電泳檢測(cè)超聲效果

純化、末端補(bǔ)平：片段化的DNA純化，并用T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端

電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳，切下含1.6-2.0kb、2.0-2.5kb及2.5-3.0kb的DNA片段的凝膠

回收：用QIAEXIIGELExtractionKit回收試劑盒從膠中回收DNA片段

連接：用T4DNA連接酶連接DNA片段和用SmaI酶切后的pUC18載體

電轉(zhuǎn)化：連接產(chǎn)物用細(xì)胞導(dǎo)入儀電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌

涂平板、重組子篩選：培養(yǎng)18小時(shí)候觀察藍(lán)白斑，白斑為重組克隆77ppt課件.培養(yǎng)組

96孔板培養(yǎng)基的分裝挑取克隆過夜培養(yǎng)菌液生長的檢測(cè)離心4度貯存

培養(yǎng)的目的是通過大腸桿菌擴(kuò)增系統(tǒng)，為測(cè)序反應(yīng)提供充足的模板國產(chǎn)96自動(dòng)分液器培養(yǎng)用96孔深孔板78ppt課件.培養(yǎng)組分裝培養(yǎng)基：8道瓶口分液器1分鐘/板出錯(cuò)率高工作強(qiáng)度高國產(chǎn)96自動(dòng)分液器30秒/板杜絕錯(cuò)誤輕松一按VSVS79ppt課件.模板組

負(fù)責(zé)測(cè)序反應(yīng)模板DNA的制備。采用堿裂解過膜法從轉(zhuǎn)化獲得的目的重組子大腸桿菌中提取目標(biāo)產(chǎn)物――插入外源DNA片段的PUC18質(zhì)粒步驟：培養(yǎng)好的克隆加I液（含Tris

、EDTA

）懸浮大腸桿菌加II液（含NaOH、SDS）裂解大腸桿菌，并使DNA、蛋白質(zhì)變性加III液（含乙酸鉀、乙酸）中和，并使DNA復(fù)性反應(yīng)液過膜

收集濾液，棄膜質(zhì)粒DNA的純化80ppt課件.模板組

96孔醋酸鉀法(1999年)96孔亞精胺法(2000年)96孔Millipore過濾膜法