生物化學-第二章-后-課件

第一節(jié)蛋白質的構件-氨基酸第二節(jié)蛋白質的共價結構第三節(jié)蛋白質的三維結構第四節(jié)結構與功能的關系第五節(jié)蛋白質的通性、純化和表征

第四節(jié)蛋白質結構與功能的關系一肌紅蛋白結構與功能血紅蛋白的結構與功能血紅蛋白的分子病免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白氨基酸序列和生物學功能一、肌紅蛋白結構與功能的關系(一)肌紅蛋白的三級結構(二)輔基血紅素(二)輔基血紅素(三)O2與肌紅蛋白的結合(四)O2的結合改變肌紅蛋白的構象(五)肌紅蛋白結合氧的定量分析(氧結合曲線)MbO2?Mb+O2K={[Mb][O2]}/[MbO2](1)Y=[MbO2]/{[Mb]+[MbO2]}(2)Y=[O2]/{[O2]+K}將（1）改寫為：

[MbO2]={[Mb][O2]}/K并代入（2）得：Log[Y/(1-Y)]=logp(O2)?logKY=[O2]/{[O2]+K}=p(O2)/{p(O2)+K}YK=p(O2)?Yp(O2)=p(O2)(1?Y)Y/(1?Y)=p(O2)/K

二、血紅蛋白的結構與功能(一)血紅蛋白的結構(二)氧結合引起的血紅蛋白構象變化肽鏈的一級結構標出的離子鍵空間結構標出的離子鍵一個配體與蛋白質上的一個結合部位結合影響同一蛋白質上其他結合部位的親和力，稱為別構效應。具有這種調節(jié)作用的蛋白質，稱為別構蛋白質能使蛋白分子發(fā)生別構作用的物質稱為效應物或調節(jié)物。(三)血紅蛋白氧合的協(xié)同性和別構效應)*協(xié)同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協(xié)同效應。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應

(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應

(negativecooperativity)(三)血紅蛋白的協(xié)同性氧結合(Hb氧結合曲線)血紅蛋白與氧結合時會發(fā)生結構變化

TR(三)血紅蛋白的協(xié)同性氧結合(Hb氧結合曲線)70%釋放非常少釋放血紅蛋白的協(xié)同性使其更發(fā)揮其運輸氧的功能(三)血紅蛋白的協(xié)同性氧結合(Hb氧結合曲線)n=1沒有協(xié)同性

n<1負協(xié)同性

n>1正協(xié)同性完全協(xié)同（四）.BPG降低血紅蛋白對氧的親和力磷酸甘油酸2.3-二磷酸甘油酸:結合在T態(tài)血紅細胞亞基之間的腔中,腔由帶正電荷的氨基酸殘基所環(huán)繞,能與BPG上的負電荷相互作用不同,血紅蛋白四聚體只與1分子2.3-二磷酸甘油酸結合;不需要輔基人的某些生理性和病理性缺氧可以通過紅細胞中BPG濃度的改變來調節(jié)對組織的供氧量γ鏈的143位為絲氨酸，而β鏈的143位為組氨酸,胎兒血紅蛋白結合BPG的能力減弱,結合O的能力增強(五）H+、CO2對血紅蛋白結合氧的影響H+、CO2

促進O2的釋放(Bohr效應)血液中CO2與碳酸氫鹽相互轉化對于調節(jié)氧的結合與釋放是非常重要的.CO2+H2OH2CO3H+HCO3HbO2+HHbH+O2pH和CO2濃度對血紅蛋白結合及釋放O的影響稱為波爾效應-+++H+、CO2

促進O2的釋放(Bohr效應)三、血紅蛋白分子病

(一)分子病是遺傳的

正常兩個亞基的第6(二)鐮刀狀細胞貧血病

(三)地中海貧血

地中海貧血癥可以由幾條途徑產生：（1）缺失一個或者多個編碼血紅蛋白鏈的基因；（2）所有基因都可能存在，但一個或者多個基因發(fā)生無義突變，或者發(fā)生移碼突變（3）所有基因都可能存在，突變影響了轉錄或者mRNA加工

(三)地中海貧血

1.β地中海貧血每條染色體有1個拷貝，β鏈丟失或者不能表達，純合子會在童年夭折（γ鏈）。雜合子癥狀較輕。2.α地中海貧血

每條染色體有2個拷貝，只要有1個拷貝正常，就不會有嚴重癥狀。4個拷貝均丟失會在出生前后死亡。(一)免疫系統(tǒng)免疫學的含義

免疫是指機體識別并清除從外環(huán)境中入侵的病原體及其毒素,和內環(huán)境中因基因突變產生的異常細胞,保持內環(huán)境穩(wěn)定的功能。

免疫學是研究免疫系統(tǒng)結構,免疫的機制,及利用免疫的方法預防和治療疾病的學科。四免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白免疫反應包括兩個系統(tǒng):體液免疫系統(tǒng)和細胞免疫系統(tǒng)通過分泌可溶性抗體清除特定抗原的途徑稱體液免疫。通過免疫細胞與受感染細胞結合而清除受感染細胞的途徑稱細胞免疫.

免疫應答涉及淋巴細胞（B細胞和T細胞）以及巨嗜細胞B細胞產生抗體（免疫球蛋白）能引起免疫應答的任何分子或病原體（病毒、細菌細胞壁、蛋白質或者其他大分子），稱為抗原(二)免疫球蛋白的結構和類別免疫球蛋白的結構免疫球蛋白G(IgG)是一類最簡單的免疫球蛋白。IgG含有兩條相同的重鏈(heavychain)和兩條相的輕鏈(lightchain)。四條鏈通過二硫鍵共價聯接成Y字形結構。每一免疫球蛋白分子含有二個抗原結合部位，它們位于Y形結構的二個頂點。(三)基于抗原-抗體相互作用的生化分析方法酶聯免疫ELISA樣品吸附到惰性表面免疫印跡測定（Western雜交）

第一節(jié)蛋白質的構件-氨基酸第二節(jié)蛋白質的共價結構第三節(jié)蛋白質的三維結構第四節(jié)結構與功能的關系

第五節(jié)蛋白質的通性、純化

和表征

第五節(jié)蛋白質的通性、純化和表征

酸堿性質膠體性質和沉淀性質蛋白質的分離純化蛋白質分子的大小與形狀一蛋白質的酸堿性質

1、兩性電解質

2、等電點

3、電泳

一酸堿性質

1、兩性電解質

蛋白質分子中除N端的-氨基，C端的-羧基外，還有許多可解離的側鏈基團。如-羧基，-羧基，-氨基，咪唑基，胍基，等，所以是兩性電解質。

各個解離基團的pK值與游離氨基酸的不完全相同。等電點要用等電聚焦等方法測定。

當蛋白質在某一pH溶液中，酸性基團帶的負電荷恰好等于堿性基團帶的正電荷，蛋白質分子凈電荷為0，在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該蛋白的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質的溶解度、粘度、滲透壓、膨脹壓和導電能力均為最小。一酸堿性質

2、等電點蛋白質的等電點要用等電聚焦等方法測定。

第五節(jié)蛋白質的通性、純化和表征

酸堿性質膠體性質和沉淀性質蛋白質的分離純化蛋白質分子的大小與形狀二膠體性質和沉淀性質-應用價值

(一)膠體性質1、蛋白質為大分子，分子量1萬-100萬，形成的顆粒直徑為1-100nm，屬于膠體范圍。

蛋白質水溶液為穩(wěn)定的親水膠體溶液(一)膠體性質

蛋白質分子表面上的可解離基團，在適當的pH條件下，都帶有相同的凈電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定的距離，不至于相互凝聚沉淀。

蛋白質分子表面的親水基團，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質表面形成一個水化層。使蛋白質顆?；ハ喔糸_，不會碰撞形成大顆粒。+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜酸堿酸堿膠體性質布朗運動

電泳現象

吸附現象

不能透過半透膜

利用其特性可以進行蛋白質的分離，純化。(二)沉淀性質

概念：蛋白質具有膠體性質，因而破壞膠體穩(wěn)定性（如破壞水化膜，中和電荷等）因素（如鹽、有機溶劑等），可使蛋白質溶液變得不穩(wěn)定而沉淀，這種現象稱為蛋白質的沉淀反應。+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉

1高濃度中性鹽沉淀反應

–可逆的（蛋白不變性）

加入高濃度的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）可破壞蛋白質的水化層（脫水），中和蛋白質的電荷，從而使蛋白質沉淀析出

2有機溶劑

–或可逆（短時間、低溫可逆）

丙酮、乙醇、甲醇等有機溶劑可破壞蛋白質的水化層（這些溶劑與水親和力大，能奪取蛋白質顆粒上的水膜，使蛋白質溶解度降低而沉淀，在等電點時加入有機溶劑更容易使蛋白沉淀）。不同蛋白質沉淀所需的有機溶劑的濃度不同，因此調節(jié)有機溶劑的濃度可使混合蛋白質達到分級沉淀的目的

3重金屬鹽–不可逆

當溶液pH值>等電點時，蛋白質顆粒帶負電荷，就容易與Hg2+、Ag+、Pb2+Cu2+等金屬離子結合成不易溶解的鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白進行解救（因蛋白能與重金屬離子形成不溶性鹽，再服用催吐劑將其排除體外）。

4生物堿試劑和某些酸類物質–不可逆當溶液pH值<等電點時，蛋白顆粒帶正點，能與苦味酸、單寧酸等生物堿試劑（能與生物堿生成沉淀或產生顏色反應的試劑）或某些酸如三氯乙酸、硝酸等的負離子根反應生成不溶性鹽而析出。

5加熱變性沉淀

幾乎所有的蛋白質都因加熱變性，少量的鹽類可以促進其凝固。我國很早就用這一性質制豆腐（大豆蛋白質濃溶液加熱并加入少量鹽鹵，含MgCl2）。等蛋白質處于等電點時，凝固會更完全或迅速。

第五節(jié)蛋白質的通性、純化和表征

酸堿性質膠體性質和沉淀性質蛋白質的分離純化蛋白質分子的大小與形狀

三蛋白質的分離純化（一）蛋白質分離純化的一般原則（二）蛋白質分離純化的方法

（一）蛋白質分離純化的一般原則

1、前處理

2、粗分級分離

3、細分級分離1、前處理

要選擇合適的材料(目標蛋白含量高容易分離);合適的破碎方法;合適的提取液(合適鹽溶液,合適的pH值)

2、粗分級分離（分離、濃縮）多種蛋白質混合物,純度不高要方法簡便，處理量大。常用高濃度鹽(鹽析)、等電點沉淀和有機溶劑分離等方法。這些方法的優(yōu)點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質溶液。有些蛋白質提取液體積較大，又不適合用沉淀法或鹽析法濃縮，可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進行濃縮。3、細分級分離（樣品的進一步純化）主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結晶法。結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。結晶既是純度的標志，也是斷定樣品處于天然狀態(tài)的有力指標。（二）蛋白質分離純化的方法

1、根據蛋白質分子大小的差別的分離

2、根據蛋白質溶解度不同的分離

3、根據蛋白質帶電性質進行分離

4、根據配體的特異性分離

5、高效液相層析和快速蛋白液相層析1、根據蛋白質分子大小的差別的分離

1）透析與超過濾

2）凝膠過濾法1).透析和超濾透析透析是把待純化的蛋白質溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內無機鹽等小分子物質降到最小值為止。原理：利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其他小分子物質如無機鹽、單糖等分開。

超濾：

利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的。

超濾是一種膜分離技術，它的特點是使用不對稱多孔膜根據分子的大小來分離溶液中的大分子物質與小分子物質。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和、非變性的物理方法，比其它分離方法有效率更高、更靈活的優(yōu)點。超濾的主要應用：濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過，從而達到濃縮的目的。

梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質分子時，超濾是一種經濟有效的方法，適用于分離相對分子質量相差10倍以上的分子組分。在超濾過程中，雖然截留的大分子被濃縮，但濾過的溶質分子仍保持初始的濃度。

脫鹽／純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質的過程。通過溶劑交換，可最有效地去除溶液中的小分子物質，并逐漸分離純化出大分子物質。具體方法為：在溶液進行超濾的同時，不斷向溶液中補充溶劑，補充溶劑的速度與溶液濾過速度相同，使體系始終保持恒定，這種方法又稱透析超濾法。2)凝膠過濾（分子排阻層析或分子篩層析）當含有各種組分的樣品流經凝膠層析柱時，大分子物質由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。1,3糖苷鍵1,6糖苷鍵環(huán)氧丙烷這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。凝膠過濾是一種柱層析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)和瓊脂糖凝膠（商品名為.Sepharose）2、根據蛋白質溶解度不同的分離

1）蛋白質的鹽析

2）低溫有機溶劑沉淀法1）蛋白質的鹽析加入高濃度的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）可破壞蛋白質的水化層（脫水），中和蛋白質的電荷，從而使蛋白質沉淀析出的現象,此現象叫鹽析在一定范圍內,蛋白質隨稀中性鹽溶液濃度增大，其溶解度也逐漸增大，此現象稱為鹽溶。（低鹽可使蛋白質表面吸附某種鹽類離子，導致其顆粒帶同性電荷增加而相互排斥加強，并于水分子作用增加，從而溶解度提高）

影響鹽析的因素有：溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶解度降低。pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低。蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質一起沉淀出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。

蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸銨，硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。

蛋白質在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入透析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2）低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。（1）降低水溶液的介電常數，離子化程度降低,使溶質溶解度降低；（2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。3、根據蛋白質帶電性質進行分離蛋白質等點電不同；蛋白質在不同pH環(huán)境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1）電泳法

2）離子交換層析法1）電泳法

在外電場的作用下，帶電顆粒，將向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）因分子量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing,IEF），利用pI不同，以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質載體，在電場作用下，兩性電解質載體在凝膠中移動，形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止。電泳雙向電泳：2）離子交換層析法纖維素離子交換劑（具有較松散的親水性網狀結構，有較大的表面積，大分子可以自由通過，容量大；纖維素糖殘基上的羥基被取代的百分比較低，電荷密度比較小，所以洗脫條件溫和，蛋白回收率較高）離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；）離子交換原理及流程示意圖4、親和層析法(根據配體的特異性分離)親和層析法（aflinitychromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力，即生物學親和力，建立起來的一種有效分離蛋白質的方法。親和層析法的基本原理：把待純化的某一蛋白質的特異配體通過適當的化學反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體（載體能允許蛋白質通過）表面的