外源基因的表達(dá)檢測(cè)及遺傳特性課件

第一章轉(zhuǎn)化外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)第二節(jié)DNA序列對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控第三節(jié)DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控第四節(jié)提高轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的策略第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)在合適的條件下,轉(zhuǎn)化的外源基因通常在數(shù)小時(shí)后就能檢測(cè)到其表達(dá)的產(chǎn)物,并在1-2天內(nèi)達(dá)到最高值,隨后又逐漸降低,至十多天后完全消失。這種短時(shí)間內(nèi)的外源基因表達(dá)稱(chēng)之為瞬時(shí)表達(dá)。1外源基因瞬時(shí)表達(dá)的機(jī)制(1)瞬時(shí)表達(dá)是未整合的外源基因的表達(dá)(2)瞬時(shí)表達(dá)是一種正常的表達(dá)方式基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專(zhuān)一性地大量增加的現(xiàn)象。擴(kuò)增的基因片斷游離在細(xì)胞核內(nèi)。2外源基因瞬時(shí)表達(dá)的影響因素(1)質(zhì)粒DNA的基因結(jié)構(gòu);(2)細(xì)胞內(nèi)源核酸酶的影響(3)受體細(xì)胞生理狀態(tài)及其內(nèi)源Gus酶抑制劑的影響;3外源基因瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用(1)在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測(cè);②優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件,選擇導(dǎo)入DNA的方法,確定農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時(shí)間等(2)植物基因表達(dá)調(diào)控的研究①啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止子的功能研究②外界因素對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響;③植物激素的調(diào)控機(jī)理。轉(zhuǎn)化外源基因的穩(wěn)定表達(dá)所謂穩(wěn)定表達(dá)是指外源基因整合到和基因組DNA分子上,并能穩(wěn)定地遺傳的外源基因的表達(dá)。需符合以下條件:(1)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng),無(wú)迅速衰退現(xiàn)象(2)DNA已整合到植物基因組中(3)能夠傳遞給后代,并符合分離規(guī)律。第二節(jié)DNA序列對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按作用方式及功能不同可將啟動(dòng)子分為三類(lèi):1.組成型啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子3.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子1.組成型啟動(dòng)子在該類(lèi)型啟動(dòng)子控制下,結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上,在不同組織部為表達(dá)水平也沒(méi)有明顯差異,為此稱(chēng)之為非特異性表達(dá)組成型啟動(dòng)子。其特點(diǎn)是:表達(dá)具持續(xù)性表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定;不表現(xiàn)時(shí)空特異性;不受外界因素誘導(dǎo);在結(jié)構(gòu)上存在六聚體花紋序列TGACTG),往往以重復(fù)形式出現(xiàn)并被6-8個(gè)核苷酸隔開(kāi)。(1)caMV35S啟動(dòng)子該啟動(dòng)子來(lái)自花椰菜花葉病毒(CaMV),其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S,故名最近發(fā)現(xiàn)35S啟動(dòng)子可以劃分為兩個(gè)區(qū)域:從90~+8為A區(qū)域,主要負(fù)責(zé)在胚根、胚乳的根及根組織內(nèi)表達(dá);從-343~90為B區(qū)域,主要負(fù)責(zé)在胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達(dá),在B區(qū)域內(nèi)的增強(qiáng)子序列可以提高表達(dá)水平。(2)