液即分配色譜法課件

層析技術(shù)概述因其操作簡(jiǎn)便、高分辨率、高靈敏度、選擇性好、樣品量少、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)適合于標(biāo)本含量少,雜質(zhì)含量多樣品分析尤其適用于生物樣品的分離分析層析技術(shù)成為已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法，是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等研究領(lǐng)域必不可少的手段和工具。二、層析技術(shù)發(fā)展史1903年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特-將碳酸鈣裝入玻璃管內(nèi)，成為柱形-抽提植物葉子得色素溶液，通過(guò)碳酸鈣柱-石油醚洗滌柱子上→下：葉綠素b,a,葉黃素，胡蘿卜素-混合物的不同組分得到了分離-得到的色帶稱(chēng)為色譜，方法命名為色譜法①②③④層析法進(jìn)行時(shí)有兩個(gè)相

固定相（支持物），流動(dòng)相（含待分離物質(zhì)）。固定相-碳酸鈣流動(dòng)相-石油醚MichaelTswett(1872-1919),theinventorofthemethodofcolumnchromatography這是利用色譜法探究生命的啟蒙和開(kāi)端,之后20多年，無(wú)人關(guān)注這一偉大發(fā)明1931年，德國(guó)庫(kù)恩重復(fù)茨維特實(shí)驗(yàn)，并分離60多種色素1938年，從VB中分離B6,出色的研究獲得1938年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1941年，英國(guó)生物化學(xué)家馬丁發(fā)展了色譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了液-液即分配色譜法-預(yù)測(cè)并實(shí)現(xiàn)氣相色譜技術(shù)，1952年將色譜技術(shù)原理應(yīng)用到分離氣體上，混合氣體通過(guò)后，在另一端出現(xiàn)時(shí)得以分離-20世紀(jì)60年代，普通色譜法已經(jīng)不能滿(mǎn)足人們對(duì)生物成分分析測(cè)試的要求-高效液相色譜，highperformanceliquidchromatography即HPLC特別適用于高沸點(diǎn)、不能氣化或熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物分離分析，生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛。

高效液相色譜法又稱(chēng)高壓高速、現(xiàn)代液相色譜法等，是在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)。高壓泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器HPLC的特點(diǎn)1.高壓2.高速3.高效

4.高靈敏度三、層析技術(shù)原理層析系統(tǒng)由兩相組成：一是固定相，另一是流動(dòng)相流動(dòng)相：攜帶流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動(dòng)的一相三、層析技術(shù)原理當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，各組分移動(dòng)速度各異，因而可將各組份分離若分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，最終達(dá)到分離各組分的目的。四、層析技術(shù)分類(lèi)吸附層析法柱層析法（高效液相層析）層析法氣相層析法超臨界層析法液相層析薄層層析法紙分配層析法其他分配層析法正相分配層析法反相分配層析法毛細(xì)管電泳凝膠滲透層析法離子交換層析法親和層析法四、層析技術(shù)分類(lèi)吸附層析法(absorptionchromatography)：固定相是固體吸附劑，利用各組份在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。分配層析(partitionchromatography)：固定相為液體，利用各組份在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。離子交換層析(ionexchangechromatography)：是以具有離子交換性能的離子交換劑作固定相，利用他與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。四、層析技術(shù)分類(lèi)凝膠層析（gelchromatography）：固定相為多孔性凝膠，利用各組份的分子大小、形狀不同，在凝膠上受阻滯的程度不同而得到分離。親和層析(affinitychromatography)：利用待分離物質(zhì)和他的特異性配體間具有特異親和力從而與其他組份分離，如免疫親和層析。以上各種層析法常應(yīng)用于柱層析(columnchromatography)中，即將固定相裝于柱內(nèi)，使標(biāo)本沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。離子交換層析原理示意圖免疫親和層析免疫親和層析五、高效液相層析高效液相層析（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)迅速發(fā)展技術(shù)由于固相填料顆粒小而均勻，會(huì)引起高阻力，采用高壓輸送流動(dòng)相，可大大加快分析速度，故又稱(chēng)高壓液相色譜高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)系統(tǒng)等組成。高效液相分析儀結(jié)構(gòu)示意圖

儲(chǔ)液器輸液泵選擇裝置層析柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)餾分裝置五、高效液相層析正相層析法：固定相極性大于流動(dòng)相極性正相層析由于極性化合物更容易被極性固定相所保留正相層析流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。正相層析法一般可用于分離純化極性大的分子，如磷脂、甾體化合物、脂溶性維生素、前列腺素等五、高效液相層析反相層析法：流動(dòng)相極性大于固定相極性反相層析流出順序極性大的先流出，極性小的后流出，與正相正好相反反相層析用于分離非極性或弱極性化合物，如氨基酸和多肽的分析,蛋白質(zhì)的分離、堿基、核酸和核酸酶的分析、甾體化合物的分析五、高效液相層析反相層析最為常用，優(yōu)點(diǎn)：反相層析用流動(dòng)相的價(jià)格比正相層析便宜對(duì)操作環(huán)境的污染較小非極性固定相表面的作用力弱，故色譜柱達(dá)到平衡比較快梯度洗脫的柱子更易于“再生”第21頁(yè)第21頁(yè)一、氨基酸測(cè)定方法概述

氨基酸檢測(cè)方法主要有篩查試驗(yàn)和定量試驗(yàn)紙層析和薄層層析法用于氨基酸分析鑒定離子交換法常用于氨基酸的分離、定量測(cè)定全自動(dòng)氨基酸分析儀應(yīng)用，可對(duì)各種體液中氨基酸進(jìn)行測(cè)定特異性強(qiáng)靈敏度高的酶法及HPLC第一節(jié)體液氨基酸測(cè)定第22頁(yè)1．氨基酸自動(dòng)分析儀采用離子交換層析方式，對(duì)蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)行分析一次進(jìn)樣檢測(cè)20～50種氨基酸，不需要更換體系，自動(dòng)完成儀器基本結(jié)構(gòu)及原理同普通HPLC相似，針對(duì)氨基酸分析細(xì)節(jié)優(yōu)化，如氮?dú)獗Ｗo(hù)、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制等樣品用量只需數(shù)十至數(shù)百微升,在30min左右,即可測(cè)出各種氨基酸含量第23頁(yè)2．HPLC法第23頁(yè)定量分析氨基酸及衍生物的技術(shù)反相層析技術(shù)使微量的氨基酸得到分離和定量大多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸收及和熒光發(fā)射特征為了提高檢測(cè)微量氨基酸的靈敏度，在HPLC前先在氨基酸上標(biāo)記能產(chǎn)生熒光或紫外有較強(qiáng)吸收的化學(xué)物質(zhì)HPLC分離后可以直接用熒光檢測(cè)儀或紫外檢測(cè)儀高靈敏度地檢測(cè)和定量各種氨基酸第24頁(yè)3.紙層析和薄層層析第24頁(yè)紙層析和薄層層析是分離鑒定微量氨基酸最簡(jiǎn)易有效的方法不需特殊設(shè)備和操作簡(jiǎn)單采集在濾紙上的標(biāo)本可以郵寄紙層析靈敏度低、分辨率差、費(fèi)時(shí)已經(jīng)逐漸被速度快、分辨率和靈敏度高的薄層色譜所代替這兩類(lèi)層析均為定性檢測(cè)第25頁(yè)4．比色法第25頁(yè)氨基酸與茚三酮加熱產(chǎn)生顯色物質(zhì)的原理設(shè)計(jì)熒光法檢測(cè)靈敏度高將其方法代替利用某些氨基酸的特性某些化學(xué)物質(zhì)和特異性的氨基酸起反應(yīng)可以產(chǎn)生有色物質(zhì)等色氨酸和甲醛縮合，并被三氯化鐵氧化，生成熒光物質(zhì)去甲哈爾曼用熒光分光光度法進(jìn)行檢測(cè)第26頁(yè)5．酶法分析第26頁(yè)某些氨基酸在特定酶的作用下發(fā)生分解或合成反應(yīng)，同時(shí)伴有NAD+與NADH之間的轉(zhuǎn)化,在340nm監(jiān)測(cè)吸光度的變化,可測(cè)定氨基酸的含量。也可在酶的作用下產(chǎn)生顯色物質(zhì)，測(cè)定吸光度的變化。

第27頁(yè)第27頁(yè)二、離子交換層析法測(cè)定氨基酸離子交換層析用離子交換劑作固定相固定相中的基團(tuán)與流動(dòng)相中的離子進(jìn)行可逆的交換分離樣品混合物，其中帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)氨基酸的離子交換分離氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的pI和溶液的pH各種氨基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一pH值時(shí)所帶正負(fù)電荷的性質(zhì)不同，所帶的電荷量也不同與離子交換樹(shù)脂的親和力有差異根據(jù)從小到大的親和力順序被洗脫液洗脫下來(lái)，達(dá)到分離的目的。

二、離子交換層析法測(cè)定氨基酸收集不同的組分第32頁(yè)二、離子交換層析法測(cè)定氨基酸測(cè)定洗脫液吸光度即可繪得洗脫曲線此計(jì)算出該蛋白質(zhì)中各種氨基酸的含量從洗脫峰的位置來(lái)判斷屬于哪一種氨基酸氨基酸分析儀就是根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)制造的自動(dòng)化分析儀氨基酸混合樣品陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫

不含有氨基酸部分控制洗脫液的流量氨基酸濃度洗脫時(shí)間陽(yáng)性離子交換樹(shù)脂分離氨基酸第34頁(yè)第34頁(yè)三、離子交換層析法性能評(píng)價(jià)1.由于離子交換層析法耗時(shí)長(zhǎng)，分析過(guò)程復(fù)雜因此在分析生物樣品時(shí)，快速敏感的反相高效液相色譜法應(yīng)用較多很微量的氨基酸樣品都可以得到分離和定量2.HPLC雖然此方法由于有較好的可靠性而被廣泛使用操作過(guò)程中樣品準(zhǔn)備以及層析分離過(guò)程復(fù)雜操作