氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結構-課件

氨基酸與蛋白質(zhì)一級結構

1ppt課件核糖體

核糖體是合成蛋白質(zhì)的細胞器,它的主要成分是蛋白與RNA,其唯一的功能是按照mRNA的指令用氨基酸合成多肽鏈。2ppt課件Theendomembranesystem（內(nèi)膜系統(tǒng)）

Manufactureanddistributionofcellularproducts（細胞產(chǎn)物的生產(chǎn)和組裝）Endoplasmicrecticulum（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）TheGolgiapparatus（高爾基體）Lysosomes（溶酶體）Vacuoles（液泡）3ppt課件生物膜細胞膜細胞器膜4ppt課件Endoplasmicrecticulum內(nèi)質(zhì)網(wǎng)5ppt課件蛋白質(zhì)的合成脂類的合成蛋白質(zhì)的修飾新生多肽的折疊與組裝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能6ppt課件7ppt課件形態(tài)結構功能高爾基體電鏡下的高爾基體

是細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)慕煌屑~完成分泌蛋白質(zhì)的最后加工和折疊8ppt課件蛋白質(zhì)修飾與加工（糖基化等）蛋白質(zhì)的分揀蛋白質(zhì)和脂的運輸?shù)鞍踪|(zhì)分泌等多糖合成（如粘液）高爾基體功能9ppt課件2.1氨基酸結構和分類2.1.1Aminoacidstructure氨基酸結構10ppt課件11ppt課件α-碳原子(分子中的第二個碳）不對稱碳原子（手性碳原子、不對稱中心或手性中心）12ppt課件Stereoisomers

在空間各原子有兩種排列方式：L—構型與D—構型，它們的關系就像左右手的關系，互為鏡像關系13ppt課件14ppt課件15ppt課件2.1.2氨基酸分類Thestandard20aminoacidsdiffer

onlyinthestructureoftheside-chainor‘R’group.20種氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈基團的化學結構分為脂肪族氨基酸（6種）、芳香族氨基酸（3種）、羥基氨基酸（2種）、堿性氨基酸(3種）、酸性氨基酸（2種）和酰胺氨基酸（2種），共七大類氨基酸。16ppt課件Hydrophobic,aliphticaminoacids

疏水的脂肪族氨基酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Leu,L）異亮氨酸（Ile,I）17ppt課件α-iminoacid:α-亞氨基酸

脯氨酸Proline:與一般的α-氨基酸不同,沒有自由的α-氨基,可以將它視為是α-氨基酸的側(cè)鏈取代了自身氨基上的一個氫原子而形成的雜環(huán)結構.18ppt課件Aromaticaminoacids

芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）19ppt課件含硫氨基酸(蛋氨酸，半胱氨酸

containingsulfuraminoacids20ppt課件Polar,unchargedaminoacids

極性,不帶電荷的氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）21ppt課件Polar,chargedaminoacids

堿性氨基酸賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）22ppt課件酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸酰胺氨基酸天冬酰胺谷酰胺23ppt課件2.2氨基酸的酸堿特性24ppt課件氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點（pI）

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK′1)(pK′2)

當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelctricpoint)。25ppt課件甘

氨

酸

滴

定

曲

線甘氨酸鹽酸鹽（A+）等電點甘氨酸（A）甘氨酸鈉（A-）一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′226ppt課件2.4肽一分子氨基酸的α－羧基和一分子氨基酸的α－氨基脫水縮合形成的酰胺鍵，即-CO-NH-，稱為肽鍵（peptidebond)。氨基酸縮合的產(chǎn)物稱為肽（peptide)。27ppt課件肽鍵

肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結構存在。則包括連接肽鍵兩端的C═O、N－H和2個Cα共6個原子的空間位置處在一個相對接近的平面上，而相鄰2個氨基酸的側(cè)鏈R又形成反式構型，從而形成肽鍵與肽鏈復雜的空間結構。28ppt課件谷胱甘肽縮宮素和血管升壓素胰島素阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲基酯）29ppt課件蛋白質(zhì)結構的主要層次

PrimarystructureSecondary

structureTertiarystructureQuariernarystructure30ppt課件2.5蛋白質(zhì)的一級結構

primarystructureTheprimarylevelofstructureinaproteinisthelinearsequenceofaminoacidsasjoinedtogetherbypeptidebonds.

Thissequenceisdeterminedbythesequenceofnucleotidebasesinthegeneencodingtheprotein.31ppt課件32ppt課件鐮刀型紅細胞貧血病

（蛋白質(zhì)一級結構改變導致功能改變）

33ppt課件通過蛋白質(zhì)一級結構的比較可以揭示

進化關系34ppt課件2.6蛋白質(zhì)純化與分析

Proteinpurification&analyses35ppt課件PrincipleofproteinpurificationSolubility溶解度Size分子大小Charge電荷Specificbindingaffinity特殊結合親和性36ppt課件Chromatographictechniques層析技術離子交換ionexchange凝膠過濾gelfiltration親和層析affinitychromatography疏水相互作用層析hydrophobicinteractionchromatographyElectrophoretictechnique電泳技術等電聚焦isoelectricfocusing十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳native37ppt課件2.6.1柱層析

columnchromatography

Ion-exchangechromatography離子交換層析Gelfiltrationchromatography凝膠過濾層析Affinitychromatography親和層析38ppt課件Ion-exchangechromatography

separationbasedupontheoverallchargeofthemolecules

39ppt課件Gelfiltrationchromatography/sizeexclusionchromatography/molecularsievechromotography40ppt課件Affinitychromatography

separationbyspecificbindinginteractionsbetweencolumnmatrixandtargetproteins

41ppt課件Lys,Leu,Glu三種氨基酸混合物要通過陽離子交換層析分離，使用pH3.5的陽離子交換柱，緩沖液也是pH3.5，哪一種氨基酸會從柱上洗脫，是否還需要其他步驟洗脫氨基酸？42ppt課件蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時(IsoelectricpointpI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。一般凝膠介質(zhì)中的pH維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質(zhì)遷移與蛋白質(zhì)的分子量和多帶電荷多少有關。43ppt課件PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳44ppt課件1.SDS45ppt課件46ppt課件47ppt課件48ppt課件2.雙向電泳雙向電泳是一種將等電聚焦電泳（IFE）與SDS結合在一起從而分辨率更高的一種電泳。水平方向反映出蛋白質(zhì)在等電點上的差異垂直方向反映出它們在相對分子質(zhì)量上的差異49ppt課件等電聚焦蛋白質(zhì)在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進行分離純化。50ppt課件2.雙向電泳51ppt課件52ppt課件雙向電泳后期分析質(zhì)譜鑒定53ppt課件2.7蛋白質(zhì)測序

Proteinsequencing確定蛋白質(zhì)由幾條多肽組成確定每條多肽鏈的N末端和C末端氨基酸殘基測定多肽鏈的氨基酸組成測定肽段氨基酸序列給出整個氨基酸序列確定二硫鍵位置54ppt課件蛋白質(zhì)一級結構的測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結構被測定。

55ppt課件(1)多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。蛋白質(zhì)一級結構的測定56ppt課件測定步驟(1)多肽鏈的拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).蛋白質(zhì)一級結構的測定57ppt課件(2)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結構的測定58ppt課件測定步驟(3)二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。蛋白質(zhì)一級結構的測定59ppt課件可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結構的測定60ppt課件(4)測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；蛋白質(zhì)一級結構的測定61ppt課件2，測定步驟(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端。蛋白質(zhì)一級結構的測定62ppt課件多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端基氨基酸測定63ppt課件Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法64ppt課件在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到110-9mol。末端基氨基酸測定

丹磺酰氯法65ppt課件氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。末端基氨基酸測定氨肽酶法66ppt課件羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根基不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。末端基氨基酸測定羧肽酶法67ppt課件2測定步驟(6)多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。蛋白質(zhì)一級結構的測定68ppt課件

酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解69ppt課件酶解目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。應用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。最常見的蛋白水解酶有以下幾種：70ppt課件Trypsin

：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。水解位點胰蛋白酶71ppt課件胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;

水解位點糜蛋白酶72ppt課件Pepsin：R1和R2均要求為疏水氨基酸。專一性與糜蛋白酶相似,但其最適pH為2,后者為8-9水解位點胃蛋白酶73ppt課件thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，異亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。水解位點嗜熱菌蛋白酶74ppt課件分別從肽鏈羧基端和氨基端水解肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶75ppt課件

化學法：(Cyanogenbromide)溴化氰水解法，它能選擇性地切割由