反膠團(tuán)萃取教學(xué)課件

反膠團(tuán)萃取36、如果我們國家的法律中只有某種神靈，而不是殫精竭慮將神靈揉進(jìn)憲法，總體上來說，法律就會更好?！R克·吐溫37、綱紀(jì)廢棄之日，便是暴政興起之時。——威·皮物特38、若是沒有公眾輿論的支持，法律是絲毫沒有力量的?！屏ζ账?9、一個判例造出另一個判例，它們迅速累聚，進(jìn)而變成法律?！炷岫蛩?0、人類法律，事物有規(guī)律，這是不容忽視的?！獝郢I(xiàn)生反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取36、如果我們國家的法律中只有某種神靈，而不是殫精竭慮將神靈揉進(jìn)憲法，總體上來說，法律就會更好?！R克·吐溫37、綱紀(jì)廢棄之日，便是暴政興起之時?！ての锾?8、若是沒有公眾輿論的支持，法律是絲毫沒有力量的?！屏ζ账?9、一個判例造出另一個判例，它們迅速累聚，進(jìn)而變成法律?！炷岫蛩?0、人類法律，事物有規(guī)律，這是不容忽視的?！獝郢I(xiàn)生反膠團(tuán)萃取技術(shù)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的產(chǎn)生傳統(tǒng)的分離方法，如液-液萃取技術(shù)很難應(yīng)用于對生化產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素等）的提取與分離，原因在于這類物質(zhì)多數(shù)不溶于非極性有機(jī)溶劑，或與有機(jī)溶劑接觸后會引起變性和失活；而鹽析、沉淀、層析、電泳等生化分離方法又不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)和放大操作。因此，針對這兩大難題，在20世紀(jì)70年代中期反膠團(tuán)萃取技術(shù)就發(fā)展起來了。一、概述反膠團(tuán)萃取技術(shù)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的產(chǎn)生

傳統(tǒng)的分離方法，如液-液萃取技術(shù)很難應(yīng)用于對生化產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素等）的提取與分離，原因在于這類物質(zhì)多數(shù)不溶于非極性有機(jī)溶劑，或與有機(jī)溶劑接觸后會引起變性和失活；而鹽析、沉淀、層析、電泳等生化分離方法又不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)和放大操作。因此，針對這兩大難題，在20世紀(jì)70年代中期反膠團(tuán)萃取技術(shù)就發(fā)展起來了。一、概述反膠團(tuán)的突出優(yōu)點(diǎn)

(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性;(2)分離、濃縮可同時進(jìn)行，過程簡便;(3)能解決蛋白質(zhì)

(如胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題;

(4)由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶;(5)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。2.1膠團(tuán)和反膠團(tuán)的形成

膠團(tuán)或反膠團(tuán)的形成均是表面活性劑分子自聚集的結(jié)果，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。（1）正向微膠團(tuán):

在水溶液中形成的膠體或微膠團(tuán)，是由于表面活性劑中極性基團(tuán)定向排列的結(jié)果?！欤卜茨z團(tuán)的形成及特性極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”

表面活性劑的極性頭部（親水基）朝外（水）

，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”。這種膠團(tuán)稱為正向膠團(tuán)，或簡稱正膠團(tuán)。膠團(tuán)的形成膠團(tuán)（2）反相膠團(tuán)

如果溶劑為非極性液體，當(dāng)加入表面活性劑至一定濃度時，由于表面活性劑的極性和非極性基團(tuán)的定向排列，也會形成微膠團(tuán)結(jié)構(gòu)。極性“頭”有機(jī)溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團(tuán)：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”。反膠團(tuán)的形成反微團(tuán)內(nèi)溶解的水稱為微水相或水池反膠團(tuán)是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水性基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴的，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。2.2常用的表面活性劑

可在非極性溶劑中形成反膠團(tuán)。在用反膠團(tuán)萃取技術(shù)分離蛋白質(zhì)的研究中使用得最多的是陰離子型表面活性劑AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名稱是丁二酸二異辛酯磺酸鈉。丁二酸二異辛酯磺酸鈉這種表面恬性劑容易獲得，其特點(diǎn)是具有雙鏈，極性基團(tuán)較小，形成反膠團(tuán)時不需加入助表面活性劑，并且形成的反膠團(tuán)較大，半徑為170nm，有利于大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入。溶劑

通常為異辛烷(2，2，4-三甲基戊烷)AOT能溶解于有機(jī)溶劑中，也能溶解于水中，并形成反相微膠團(tuán)。AOT在形成反膠團(tuán)時的Wo值較大，可達(dá)170。因此在反相微膠團(tuán)內(nèi)就可以溶解較多的生物大分子而提高了萃取效率。2.3反膠團(tuán)的兩個特異性功能

(1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能;(2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。2.4反膠團(tuán)的形狀和大小

反膠團(tuán)的形狀多為球形或近似球形，有時也呈柱狀結(jié)構(gòu)，其半徑一般為10～100nm。膠團(tuán)的大小取決于鹽的種類和濃度、溶劑和表面活性劑的種類和濃度以及溫度等。2.5Wo值

表征膠團(tuán)大小較好的參數(shù)是Wo——水與表面活性劑的摩爾比。用非極性溶劑中的水濃度和表面活性劑濃度之比來表示:

Wo=[H20]/[表面活性劑]Wo值的物理意義

Wo值越大，反相微膠團(tuán)內(nèi)的水分含量就越多，形成的反相微膠團(tuán)的半徑就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此，Wo值大小可以反映出反相微膠團(tuán)的大小和溶解能力。2.6CMC

表面活性劑的臨界濃度：

表面活性劑要形成反相微膠團(tuán)，在溶劑中的濃度必須達(dá)到一定值，否則就不能形成微膠團(tuán)，這個形成微膠團(tuán)所必需的最低濃度值，叫做表面活性劑形成微膠團(tuán)的臨界濃度(CMC)。

不同的表面活性劑的CMC值在0.l-1.0mmol/L之間，隨溫度、壓力和溶劑的變化而變化。2.7水池的性質(zhì)

表面活性劑分子的聚集使反膠團(tuán)內(nèi)形成極性核，反膠團(tuán)內(nèi)溶解的水通常稱為微水相或“水池”。由于反膠團(tuán)內(nèi)存在“水池”，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供適宜存在的親水微環(huán)境。因此，“水池”的物理化學(xué)性質(zhì)直接影響到反膠團(tuán)萃取的適用范圍和效率。當(dāng)反膠團(tuán)的含水率較低時，反膠團(tuán)“水池”內(nèi)水的理化性質(zhì)與正常水相差懸殊。例如，以AOT為表面活性劑，當(dāng)wo小于6～8時，反膠團(tuán)內(nèi)微水相的水分子受表面活性劑親水基團(tuán)的強(qiáng)烈束縛，表觀黏度上升50倍，疏水性也極高。隨著wo的增大，這些現(xiàn)象逐漸減弱，當(dāng)wo大于16時，微水相的水與正常的水接近，反膠團(tuán)內(nèi)可形成雙電層。

即使當(dāng)wo值很大時，“水池”內(nèi)水的理化性質(zhì)也不可能與正常的水完全相同，特別是接近表面活性劑親水頭的區(qū)域內(nèi)。反膠團(tuán)內(nèi)的水由于表面活性劑分子極性頭電離具有很高的電荷濃度，因此“水池”中水的pH值不同于主體水的pH值。

這一結(jié)論對于在反膠團(tuán)內(nèi)固定蛋白質(zhì)的研究尤為重要?！?反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的過程

蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)溶液是一種協(xié)同過程，即在宏觀兩相(有機(jī)相和水相)界面間的表面活性劑層，同鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用而變形，接著在兩相界面形成了包含有蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)，此反膠團(tuán)擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。改變水相條件(如pH值和離子種類及其強(qiáng)度等)又可使蛋白質(zhì)由有機(jī)相重新返回水相，實(shí)現(xiàn)反萃取過程生物大分子反膠團(tuán)形成的方法最常用到的有3種:（1）注入法（2）轉(zhuǎn)移法（3）溶解法（1）注入法

通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)萃取過程。（2）相轉(zhuǎn)移法

通過將含生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機(jī)相接觸，緩慢地?cái)嚢瑁谛纬煞聪蛭⒛z團(tuán)的同時，其中的生物大分子即轉(zhuǎn)入到反相微膠團(tuán)中，直到處于萃取平衡狀態(tài)為止。（3）溶解法

對于固體粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法進(jìn)行。3.1蛋白質(zhì)溶入反膠團(tuán)的推動力

蛋白質(zhì)溶解于反膠團(tuán)的主要推動力是表面活性劑與蛋白質(zhì)的靜電相互作用。此外，反膠團(tuán)與蛋白質(zhì)等生物分子間的空間相互作用對蛋白質(zhì)的溶解率也有重要影響。3.1.1靜電作用力

在反膠團(tuán)萃取體系中，表面活性劑與蛋白質(zhì)都是帶電的分子，因此靜電相互作用是萃取過程中的一種主要推動力。其中一個最直接的因素是pH值，它決定了蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)的離解速率及蛋白質(zhì)的凈電荷，這與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI有關(guān)。即隨著pH值的改變，被萃取蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和帶電量是不同的。

對于陽離子表面活性劑形成的反膠團(tuán)體系，萃取只發(fā)生在水溶液的pH>pI時，此時蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭問相互吸引；

pH<pI時，靜電排斥力將抑制蛋白質(zhì)的萃取。對于陰離子表面活性劑形成的反膠團(tuán)體系，情況正好相反。3.1.2空間位阻效應(yīng)

反膠團(tuán)“水池”的物理性能(大小、形狀等)及其中水的活度是可以用Wo的變化來調(diào)節(jié)的，并且會影響大分子如蛋白質(zhì)的增溶或排斥，達(dá)到選擇性萃取的目的，這就是所謂的位阻效應(yīng)。許多反膠團(tuán)萃取的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，隨著Wo的降低，反膠團(tuán)直徑減小，空間位阻作用增大．蛋白質(zhì)的萃取率也減少?？臻g位阻效應(yīng)也體現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子大小對分配系數(shù)的影響上。在各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處的反膠團(tuán)萃取實(shí)驗(yàn)研究表明，隨著蛋白質(zhì)分于量的增大，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(溶解率)下降。當(dāng)相對分子質(zhì)量超過20000時，分配系數(shù)很小。該實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處進(jìn)行，排除了靜電相互作用的影響，表明隨分子量增加，空間位阻作用增大，蛋白質(zhì)萃取率下降。因此，也可以根據(jù)分子量的差異利用反膠團(tuán)萃取實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)選擇性分離。3.2影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的主要因素

由上述分析可知，任何可以增加蛋白質(zhì)與反膠團(tuán)的靜電作用或?qū)е滦纬奢^大反膠團(tuán)的因素，都有助于蛋白質(zhì)的萃取。影響反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的主要因素，見表2-10。只要通過對這些因索進(jìn)行系統(tǒng)的研究，確定最佳操作條件，就能得到合適的目標(biāo)蛋白質(zhì)萃取率。從而達(dá)到分離純化的目的。(1)水相pH值的影響

水相的pH值決定了蛋白質(zhì)表面電荷的狀態(tài)，從而對萃取過程造成影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所帶的電荷與反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷，也就是表面活性劑極性基團(tuán)所帶的電荷性質(zhì)相反時，由于靜電引力，可使蛋白質(zhì)溶于反膠團(tuán)中。(2)離子的種類和強(qiáng)度的影響

與反膠團(tuán)相接觸的水溶液離子強(qiáng)度以幾種不同方式影響著蛋白質(zhì)的分配。①離子強(qiáng)度增大后，反膠團(tuán)內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠團(tuán)內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度。②反膠團(tuán)內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團(tuán)之間的斥力，使反膠團(tuán)變小，從而使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入其中。

③離子強(qiáng)度增加時，增大了離子向反膠團(tuán)內(nèi)“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)內(nèi)再被鹽析出來。④鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可以改變?nèi)芙庑阅埽}的濃度越高，其影響就越大。陽離子的種類對萃取率的影響

如Mg2+、Na+、Ca2+、K+對萃取率的影響主要體現(xiàn)在改變反膠團(tuán)內(nèi)表面的電荷密度上。通常反膠團(tuán)中表面活性劑的極性基團(tuán)不是完全電離的，有很大一部分陽離子仍在膠團(tuán)的內(nèi)表面上(相反離子締合)。極性基團(tuán)的電離程度愈大，反膠用內(nèi)表面的電荷密度愈大，產(chǎn)生的反膠團(tuán)也愈大。表面活性劑電離的程度與離子種類有關(guān)。同一離子強(qiáng)度下的四種離子對反膠團(tuán)的Wo的影響見表2-11。由表211-可知，極性基團(tuán)的電荷密度按K+

、Ca2+、Na+、Mg2+的順序逐漸增大，電離程度也相應(yīng)的增大。(3)表面活性劑的種類和濃度的影響

陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑都可用于形成反膠團(tuán)，關(guān)鍵是應(yīng)從反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理出發(fā)，選用有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面電荷與反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠團(tuán)大小的表面活性劑。除此以外，還應(yīng)考慮形成反膠團(tuán)及使反膠團(tuán)變大(由于蛋白質(zhì)的進(jìn)入)所需的能量的大小以及反膠團(tuán)內(nèi)表面的電荷密度等因素，這些都會對萃取產(chǎn)生影響。

增大表面活性劑的濃度可增加反膠團(tuán)的數(shù)量，從而增大對蛋白質(zhì)的溶解能力。但表面活性劑濃度過高時，有可能在溶液中形成比較復(fù)雜的聚集體，同時會增加反萃取過程的難度。因此，應(yīng)選擇蛋白質(zhì)萃取率最大時的表面活性劑濃度為最佳濃度。(4)溶劑體系的影響

溶劑的性質(zhì)，尤其是極性，對反膠團(tuán)的形成和大小都有很大的影響，常用的溶劑有烷烴類(正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等。有時也添加助溶劑，如醇類(正丁醇等)來調(diào)節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團(tuán)的大小，增加蛋白質(zhì)的溶解度。§4反膠團(tuán)萃取的過程及工藝開發(fā)4.1反膠團(tuán)萃取過程水相中的溶質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)相需經(jīng)歷三步傳質(zhì)過程：①通過表面液膜從水相到達(dá)相界面；

②在界面處溶質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中