優(yōu)選熒光定量儀介紹課件

優(yōu)選熒光定量儀介紹Rotor-Gene6000的升降溫示意圖。Rotor-Gene6000具有轉(zhuǎn)子式設(shè)計樣品以400rpm持續(xù)離心，防止樣品凝結(jié)，除去氣泡，省去了反應(yīng)前離心步驟。樣品在空氣倉內(nèi)加熱和降溫。通過蓋上的鎳鉻線圈加熱。通過頂部氣孔將熱空氣排出，底部風(fēng)扇吹入冷空氣實現(xiàn)降溫。

Rotor-Gene6000光學(xué)系統(tǒng)示意圖。

可自選的6個激發(fā)光源和6片檢測濾鏡樣品由反應(yīng)倉底部的的發(fā)光二極管激發(fā)能量通過薄壁管底部激發(fā)染料發(fā)射熒光通過反應(yīng)倉側(cè)壁的發(fā)射濾鏡由光電倍增管收集光信號常用配件36-孔轉(zhuǎn)子 36-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán) 72-孔轉(zhuǎn)子 72-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán) Rotor支架 準(zhǔn)備一個反應(yīng)1.選擇轉(zhuǎn)子類型36孔轉(zhuǎn)子及壓環(huán)，使用0.2ml的管子，在實驗中最為常用。管子無需是頂部透明的，因為熒光信號是由管底部檢測的?，F(xiàn)在同樣可以使用圓蓋的管子。

72孔轉(zhuǎn)子和壓環(huán)，使用0.1ml的四聯(lián)管，它允許最小達(dá)5ul的反應(yīng)體積。它的蓋子提供了安全可靠的密封性準(zhǔn)備一個反應(yīng)2.反應(yīng)設(shè)置將反應(yīng)管插入樣品板、分裝試劑蓋好管蓋，確保蓋緊。準(zhǔn)備一個反應(yīng)將三針壓環(huán)固定在轉(zhuǎn)子上，壓環(huán)保證了反應(yīng)中蓋子與管子的緊密結(jié)合。反應(yīng)管插入相應(yīng)的轉(zhuǎn)子，確保每個管子都正確放置，可選配轉(zhuǎn)子支撐架以便于管子的放置。為了達(dá)到最大的溫度均一性，轉(zhuǎn)子中的每個孔都必需放置有管子。將插好管子的轉(zhuǎn)子固定在Rotor-Gene的中心轉(zhuǎn)軸上。軸上的位置指針保證轉(zhuǎn)子的正確安裝。要拆下轉(zhuǎn)子，只需推動上部的轉(zhuǎn)子桿即可釋放轉(zhuǎn)子。設(shè)置一個運行新的反應(yīng)可用快速啟動進(jìn)行設(shè)置。快速啟動向?qū)共僮髡吣軌虮M快的完成設(shè)置，開始一個反應(yīng)，向?qū)?nèi)含有多個程序模板，它們包括了默認(rèn)的循環(huán)條件下及采集通道。第一步是選擇一個運行模板：PerformLastRun:從上一個反應(yīng)中導(dǎo)入循環(huán)設(shè)置、通道設(shè)置及樣品定義。ThreeStepwithMelt：三步法并運行熔解曲線，信號采集為FAM/SYBR通道。TwoStep：雙標(biāo)記探針，默認(rèn)兩步法，信號采集為所有通道。設(shè)置一個運行選擇轉(zhuǎn)子類型選中壓環(huán)已蓋緊的小框，以繼續(xù)向?qū)Р僮髟O(shè)置一個運行可輸入操作者的名字及注釋信息必需輸入PCR反應(yīng)體積。反應(yīng)體積為20-25uL設(shè)置一個運行修改溫度循環(huán)通道設(shè)置點擊EditProfile編輯鍵進(jìn)入編輯器以修改循環(huán)條件及選擇采集通道設(shè)置一個運行流程編輯器在選中的循環(huán)后插入一個循環(huán)在選中的循環(huán)前插入一個循環(huán)從流程中刪除選中的循環(huán)設(shè)置一個運行設(shè)定循環(huán)的重復(fù)數(shù)設(shè)定溫度/時間窗口中顯示了每一個循環(huán)點擊左側(cè)溫度和時間指示并進(jìn)行修改通過右側(cè)的+/-鍵進(jìn)行添加或刪除循環(huán)設(shè)置一個運行采集可在循環(huán)中的任一步，任一個通道設(shè)置點擊NotAcquisition鍵。點擊后，會顯示采集窗口。設(shè)置一個運行染料通道選擇表可以根據(jù)使用的染料找出相應(yīng)的通道要設(shè)置采集通道，只需將可用通道列表中的通道添加到采集通道中即可設(shè)置一個運行完成設(shè)置后點擊Calibrate校正…鍵以進(jìn)入增益值校正窗口設(shè)置一個運行自動增益校正讓機器自動進(jìn)行校正，直至所有選中的通道的熒光讀數(shù)都落在一個閾值范圍內(nèi)；優(yōu)化所有/優(yōu)化采集：“優(yōu)化所有”將校正軟件所知的所有通道。選擇“優(yōu)化采集”將只校正該反應(yīng)中所用到的通道（循環(huán)和熔解）；通道設(shè)置：這是一個下拉式的菜單，允許你向增益值校正窗口中添加新的通道，選中需要的通道并點擊添加。設(shè)置一個運行總結(jié)反應(yīng)的總體情況。確定參數(shù)設(shè)置。點擊StartRun開始反應(yīng)。

設(shè)置一個運行此時會彈出文件保存<Saveas>窗口該文件包括一次運行的所有信息設(shè)置一個運行當(dāng)反應(yīng)開始后，可以在等待反應(yīng)完成的這段時間里輸入樣品的類型及描述。這一界面的功能與樣品編輯器完全一致。你同樣也可以在反應(yīng)結(jié)束后對樣品進(jìn)行編輯。程序運行后，可以在軟件界面上實時觀察到如下的窗口：顯示原始的熒光信號收集界面，溫度界面和反應(yīng)進(jìn)程界面，窗口右邊是樣品信息欄。通過此界面可以實時檢測PCR反應(yīng)，反應(yīng)剩余時間，以及升降溫情況。原始的熒光信號收集界面溫度界面反應(yīng)進(jìn)程界面反應(yīng)完成后，可通過“Analysis”鍵，對結(jié)果進(jìn)行分析。選擇所需要的分析方法，如：定量分析，熔解曲線分析等之后，按<Show>鍵，則可以在窗口中看到相關(guān)圖表結(jié)果?！癘ther…”里有其他分析方法。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介先對樣品中的目的基因與看家基因分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定兩個基因的擴增效率是否一致或接近，將擴增效率優(yōu)化為一致；同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目的基因的擴增，分列在兩頁中ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介反應(yīng)最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長，但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。當(dāng)累積了足夠的擴增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即Ct。由于Ct值處于指數(shù)期內(nèi)，這時的反應(yīng)成分不會抑制擴增反應(yīng)進(jìn)行，因此熒光定量PCR結(jié)果是可靠的，可以準(zhǔn)確的反映反應(yīng)體系中模板的初始量。假定的例子介紹使用Delta-deltaCt法來決定一個目標(biāo)基因（p53）在腫瘤和正常卵巢組織的表達(dá)的相對水平。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介例子：正常和腫瘤組織50ngRNA得到的cDNA用來分析p53（目標(biāo)基因）和GAPDH（參照基因）。研究表明GAPDH在正常和腫瘤組織中沒有差異。樣品Ct

p53（目標(biāo)基因）CtGAPDH（參照基因）正常（校準(zhǔn)樣本）15.016.5腫瘤（試驗樣本）12.015.9進(jìn)行相對定量分析之前，在檢測和校準(zhǔn)的樣品中靶基因的Ct值和內(nèi)參的Ct值進(jìn)行歸一化：

△Ct（正常）=15.0-16.5=-1.5△Ct（腫瘤）=12.0-15.9=-3.9然后，試驗樣本與校準(zhǔn)樣本的△Ct值進(jìn)行歸一化△△Ct

=△Ct（腫瘤）-△Ct（正常）=-3.9-(-1.5)=-2.4最后，計算表達(dá)比率：2-△△Ct

=2-（-2.4）=5.3因此，腫瘤組織細(xì)胞的p53表達(dá)水平比正常細(xì)胞高5.3倍。ComparativeDelta-deltaCt法的特點、注意事項1).ComparativeDelta-deltaCt法是常用的相對定量方法，其最大特點是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)行PCR擴增即可。2).其缺點是，每次實驗都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，這里勢必存在一定的誤差。3).ComparativeDelta-deltaCt法展開定量實驗前，在預(yù)實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene的軟件會自動給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，那么后續(xù)實驗中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進(jìn)行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介應(yīng)用實例：將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，分別對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并給出相應(yīng)的參數(shù)。兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的M值的差值<0.1ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介在完成上述預(yù)實驗之后，接下來就可以正式對待測樣品進(jìn)行定量分析。在該實驗中，分別對待測樣品的看家基因和目的基因進(jìn)行擴增，下圖即為一個標(biāo)準(zhǔn)的擴增分析結(jié)果：為進(jìn)行ComparativeDelta-deltaCt分析，需要對樣品進(jìn)行一些編輯。簡而言之，即將目的基因和看家基因分別編輯在兩頁中（page），并將同一樣品命名成相同名稱。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介在該實驗中，分別對三個樣品A、B、C進(jìn)行了分析，其中1-9號管檢測了看家基因，10-18號管檢測了目的基因?？赏ㄟ^NEW新建一個page，并通過Selected選擇每頁中分析的對像。將兩組基因分別編輯在兩頁中，并將相同的樣品命名成同一名稱后，即為下圖所示：ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介Page2：目的基因，其中10-18號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進(jìn)行編輯。Page1：看家基因，其中1-9號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進(jìn)行編輯。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作。通過進(jìn)入Analysis，分別對page1和page2進(jìn)行分析。注意：由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品，軟件無法自動給出閾值，需用手動設(shè)定，軟件會提示需手動進(jìn)行閾值設(shè)定，此時只要在熒光曲線圖中上下拖動光標(biāo)即可。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介完成兩頁分析之后，再進(jìn)入DeltaDeltaCT分析界面，選擇show，此時，軟件的向?qū)Ы缑鏁崾臼褂谜咭徊酵瓿稍O(shè)置：第一項：ValidationRunPerformed，提示是否已驗證過兩個基因的擴增效率一致，可用該定量方法進(jìn)行分析。選擇Yes；第二項：GeneofInterestQuantitation，選中Page1或Page2中編輯了目的基因的那一頁；第三項：NormaliserQuantitation，選中Page1或Page2中編輯了看家基因的那一頁；第四項：CalibratorDefined，選中A、B、C三個樣品中用來作為對照組的一個。ComparativeDelta-deltaCt定量流程簡介完成上述四項設(shè)置之后，在窗口右側(cè)就顯示相對定量結(jié)果，如圖所示：結(jié)果給出三個樣品目的基因和看家基因的平均CT值，以及樣品B、C中目的基因的濃度相對于對照組A的比值。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程1).用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量時，每次每個基因都需要做目的基因和看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，必需有一組穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品。2).同一樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分列在兩頁上。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

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法

定

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程雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點、注意事項及實際應(yīng)用1.雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對定量分析的最大特點是，應(yīng)用簡便，無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進(jìn)行嚴(yán)格的優(yōu)化。2.其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.并且，如果用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不同于樣品，比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)粒或純化的PCR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程樣品管1-6為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，7-12為看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；待測樣品A、B、C，

15-17擴增了樣品的看家基因，18-20擴增了樣品的目的基因。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程在用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對定量之前，同樣需要對樣品進(jìn)行一些編輯。方法與Delta-deltaCT法類似，即將所有目的基因編輯在一個page里，所有看家基因編輯在另一個page里，且相同的樣品以同樣名稱命名。Page1：看家基因，其中7-12號管為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過YES選中，15-17號管為待測樣品，分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可不以不進(jìn)行編輯。Page2：目的基因，其中1-6號管為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過YES選中，18-20號管為待測樣品，分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可不以不進(jìn)行編輯。雙

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

法

定

量

流

程樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作，從Other進(jìn)入，選擇2StandardCurvesRelativeQuantitation。根據(jù)提示向?qū)б来瓮瓿稍O(shè)置。依次選中目的基因的page、看家基因的page以及對照組（例，以A為對照組）雙

標(biāo)

準(zhǔn)