腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟及方法

腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟及方法腺病毒（Adenovirus,ADV）是一種線性雙鏈DNA病毒。腺病毒不僅可以作為哺乳動物基因轉(zhuǎn)移載體而得到廣泛應(yīng)用，亦可被用來在人體細(xì)胞中過量表達(dá)蛋白（Massieetal.,1998a,b）。迄今為止已有大量關(guān)于腺病毒及其應(yīng)用的綜述表明：重組腺病毒在科學(xué)研究和治療應(yīng)用領(lǐng)域都具有很大的潛力，同時作為基因轉(zhuǎn)移工具相對于其他病毒載體有多方面的優(yōu)勢。運用了去除5'ITR、包裝信號和E1序列的全新的腺病毒骨架基因，無需進(jìn)行細(xì)菌體內(nèi)的同源重組步驟，無需使用多蝕斑分離方法分離目的重組腺病毒的步驟，因此較其他系統(tǒng)生長更快，并且大大降低了重組形成野生型可復(fù)制腺病毒的危險；無Ela，不產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒，因此更為安全。二、腺病毒載體優(yōu)勢1）可感染的細(xì)胞種類多，宿主范圍廣，幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞；2）感染效率高，重組腺病毒被廣泛應(yīng)用于使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較低細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)；3）包裝外源基因的片段大，高達(dá)8kb；4）腺病毒載體構(gòu)建及包裝容易操作，易于制備出滴度高的大量病毒；5）當(dāng)腺病毒感染細(xì)胞后，病毒基因組存在于細(xì)胞染色體外，不整合到細(xì)胞染色體中，避免了因整合引起的基因突變及激活致癌基因，生物安全性高。三、流程描述制備腺病毒顆粒的穿梭質(zhì)粒及其骨架質(zhì)粒，上述質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，用轉(zhuǎn)染試劑RNAi-Mate進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)3染6小時后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-15天，每3天左右補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)基，然后收集細(xì)胞和上清液置于離心管中，凍融三次，4000rpm離心10分鐘，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復(fù)擴(kuò)增收集病毒后，腺病毒的大量擴(kuò)增，而后對其純化和濃縮后得到高滴度的腺病毒濃縮液，在293A細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。在一定滴度范圍內(nèi)的腺病毒顆粒可以滿足大部分體內(nèi)體外實驗需求。四、具體步驟細(xì)胞培養(yǎng)活細(xì)胞計數(shù)用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200~2000個/ml（一般稀釋倍數(shù)為100倍），在0.1ml的細(xì)胞懸液中加入0.1ml的0.4%的臺盼藍(lán)溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺盼藍(lán)，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。細(xì)胞株的凍存1）取培養(yǎng)2~3天生長旺盛的細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2x106-2xl07/ml。2）在1ml細(xì)胞凍存管中加入0.5ml細(xì)胞懸液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞砜（或甘油），混勻后密封。置4°C，1小時，-20°C，2小時，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。細(xì)胞復(fù)蘇1）從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，應(yīng)帶防護(hù)眼睛和手套。2）迅速放入盛有37°C水的水浴中，并不時搖動，盡快解凍。3）2000rpm，離心3分鐘。4）用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出上清液，加3ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，加入到6cm培養(yǎng)皿中，置溫箱培養(yǎng)。5）次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代1）棄去舊培養(yǎng)液，加入5ml滅菌PBS溶液，輕輕晃動，洗滌細(xì)胞生長面，然后棄去PBS溶液。2）加入2ml胰酶消化液，消化1-2分鐘直到細(xì)胞完全消化下來。3）加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基5ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來。4）混勻細(xì)胞后分至兩個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。病毒包裝1）293A細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80-90%融合時，接種6cm培養(yǎng)皿。2）傾去培養(yǎng)液，用1mlD-Hank'ssolution洗滌細(xì)胞兩次。3）加入1mlTrypsin-EDTAsolution，混勻后，37°C放置2-3分鐘。4）小心吸去胰酶溶液，加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。5）將0.5ml細(xì)胞懸液接種6cm培養(yǎng)皿，加入4ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，混勻后37°C5%CO2培養(yǎng)過夜。6）在一支無菌的1.5ml離心管中加入0.5ml無血清DMEM，按比例加入含客戶目的序列的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒，混勻，取另一支無菌的1.5ml離心管，加入0.5ml無血清DMEM，再加入10-15plRNAi-Mate，混勻，室溫放置5分鐘后將兩管混合，室溫放置20-25分鐘。7）除去6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入3ml無血清的DMEM培養(yǎng)液。8）將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入6cm培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物，在37°C5%CO2培養(yǎng)箱中溫育4-6小時。9）吸棄轉(zhuǎn)染液，加入4ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。37°C5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。病毒收集1）孵育7天后，檢查是否存在空斑。如果可以收獲（剩余＞50%的細(xì)胞），然后收集病毒裂解原液。如果不能收獲，添加1ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在CO2，37°C下孵育。第10天，檢查是否存在空斑。如果可以收獲（剩余＞50%的細(xì)胞），然后收集病毒裂解原液。如果不能收獲，添加1ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在CO2，37°C下孵育。持續(xù)檢查是否存在空斑，但不要超過15天。3）用5或10ml無菌吸管將含腺病毒的細(xì)胞從皿上吹下，將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個15ml管中，必要時使用細(xì)胞刮。4）37°C水浴和干冰-甲醇浴，每次10分鐘，反復(fù)凍融三次釋放病毒。5）室溫下，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物在臺式離心機(jī)中以3000rpm離心15分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。6）分裝并-80°C儲存病毒裂解原液（初始病毒原料）。病毒擴(kuò)增1）感染前一天，按3-5x106個細(xì)胞鋪一個15cm培養(yǎng)皿。2）加入50%的上述病毒裂解原液至培養(yǎng)基。我們建議使用大于〉0.5PFU（空斑形成單位）或足夠的病毒使細(xì)胞在48h內(nèi)表現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPEs）。3）在感染24-48小時，每天兩次顯微鏡下檢查細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。當(dāng)CPE是接近完成（即大多數(shù)細(xì)胞呈葡萄球狀，但尚未脫離瓶底）時，用移液管將感染的細(xì)胞從皿上吹到培養(yǎng)基中，收獲細(xì)胞。4）合并感染的細(xì)胞和培養(yǎng)基。在1000g下離心5分鐘沉淀細(xì)胞。吸棄上清液,用培養(yǎng)基或10mMTris,pH8.0,100mMNaCl重懸細(xì)胞（每15cm培養(yǎng)皿0.25-0.5ml）。5）反復(fù)凍融三次釋放腺病毒，3000g，10分鐘離心，以沉淀細(xì)胞碎片。棄去沉淀，保存病毒上清物。6）病毒上清可以儲存在-80°C,或立即純化或滴度檢測。病毒純化1）病毒純化采用CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，CsCl梯度的制備方法如下：加入2.0ml密度為1.40g/ml的CsCl溶液,然后緩慢加入3.0ml密度為1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒懸浮液。2）20000rpm，室溫離心2小時3）收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之間的病毒條帶至透析袋中（透析袋使用前用10mM的EDTA-Na2煮沸10min）在透析緩沖液（50g蔗糖，10ml1MTris-HCl,PH8.0,2ml1MMgC12定容至1L）中。4）4°C攪拌透析過夜,中間換一次透析液。收集病毒。病毒保存1）—周內(nèi)使用則置于4度冰箱保存。2）如需長時間存放需置于-80°C甚至液氮保存。病毒滴度檢測1）采用微量全細(xì)胞病變法檢測病毒滴度（參考復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所方法）取96孑L板1塊，每孔加入293細(xì)胞104個，加液量100卩1，置孵箱培養(yǎng)24h。待測病毒用DMEM全培養(yǎng)基稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀釋度。吸去上清后，分別加入每個稀釋度的病毒液體，每孔100卩1,每種樣本均作復(fù)孔，同時設(shè)培養(yǎng)基對照（不含腺病毒）。再置于37°C,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)36-48h。鏡檢觀察CPE現(xiàn)象，計算病毒滴度。2）按MOI100接種腺病毒后72h,40倍光鏡下觀察,293細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE。3）現(xiàn)象：95%-100%的細(xì)胞變圓，其中約60%脫落浮起，未浮起者有聚集融合現(xiàn)象。收集并裂解細(xì)胞獲得待測腺病毒。4）用微量全細(xì)胞病變法檢測腺病毒滴度。按104/孔293細(xì)胞接種腺病毒后36-48h,觀察到在10-2、10-3稀釋度的樣本中293細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE現(xiàn)象：90%細(xì)胞變圓,10%細(xì)胞浮起。按上述公式計算擴(kuò)增所得腺病毒的滴度約為5x108PFU/m1。（通過不同的檢測方法，滴度會有差異，并請在試驗過程中注意生物安全要求。）五、使用方法重組腺病毒在細(xì)胞水平使用腺病毒有很廣泛的宿主范圍，可以感染多數(shù)人類或者其他哺乳動物細(xì)胞系或部分原代細(xì)胞。要得到最佳的實驗結(jié)果，確定腺病毒的最佳用量是非常重要的。用量不足，則不能達(dá)到理想的感染效率；用量過大，會對細(xì)胞有毒害作用或者其他不可預(yù)測的效應(yīng)。最佳用量因不同的細(xì)胞類型而有顯著差異。為了確定最適病毒用量，可使用攜帶報告基因的陰性對照腺病毒做預(yù)實驗。用不同稀釋倍數(shù)的陰性對照腺病毒感染細(xì)胞，在感染1-3天后檢測感染效率。通過在顯微鏡下觀察細(xì)胞的報告基因的表達(dá)情況來確定既達(dá)到所需感染效率又不會引起細(xì)胞表型變化的病毒濃度范圍病毒滴度復(fù)核（有限稀釋法測定）1）滴度檢測前一天，對293A細(xì)胞傳代，96孔板每個孔加入約0.5-10x103個細(xì)胞，體積100卩1。2）第二天，準(zhǔn)備7-10個無菌EP管，在每個管中加入90卩1的新鮮完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10%FBS）。3）取待測定的病毒原液10卩1加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10卩1加入到第二個管中，然后依次操作直到最后一管。4）選取所需的細(xì)胞孔，吸棄90卩1培養(yǎng)液，然后將稀釋好的病毒液，從低濃度到高濃度依次加入，放入37°C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5）24小時后，每孔換入100卩1新鮮培養(yǎng)液，小心操作，不要吹起細(xì)胞；放入37°C5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6）1-3天后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少，計數(shù)最后二個含有熒光細(xì)胞的孔中的熒光細(xì)胞個數(shù)，將得到的數(shù)值除以各自相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可計算出病毒原液的滴度值（通常以倒數(shù)第二個孔中的讀數(shù)值更為準(zhǔn)確）。靶細(xì)胞感染預(yù)實驗1）試驗前一天分別接種3-5x103個目的細(xì)胞于96孑L培養(yǎng)板每孔中，所加培養(yǎng)基體積為100叭不同種類的細(xì)胞生長速度有所差異,為保證有較好的實驗結(jié)果，進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度為60-80%。因為腺病毒表達(dá)需要一定的時間，故在進(jìn)行感染實驗時細(xì)胞接種不宜過密。2）干擾預(yù)試驗共分為二組，每組均有不同梯度的MOI值（Mu1tip1yofInfection）。第一組為正常情況下感染，也就是在完全培養(yǎng)基中直接加入病毒。第二組為感染時添加3-8pg/m1的Po1ybrene。Po1ybrene在大部分細(xì)胞中可以有效的提高感染效率。3）感染前為細(xì)胞換液，吸去細(xì)胞上清,按不同的分組情況加入所需的培養(yǎng)基90卩1,每組三個復(fù)孔。4）準(zhǔn)備3個無菌的EP管，吸取10卩1的lxlO8PFU/ml的病毒（預(yù)先從-80°C取出，迅速融化，4°C低溫操作）加入到第一個管子中，輕柔混勻，勿產(chǎn)生泡沫。同樣從第一管中吸取10卩1的病毒到第二管中，混勻。再從第二管中吸取10卩1的病毒到第三管中，混勻。這樣就得到了四個不同梯度的病毒：原液，10倍稀釋，100倍稀釋，1000倍稀釋。5）把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱孵育。6）8-12小時以后，請觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異，表明腺病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，請不要換液，繼續(xù)培養(yǎng)，直至24小時后更換為新鮮培養(yǎng)基。7）感染48-72小時后，觀察熒光表達(dá)情況。對于生長遲緩代謝慢的細(xì)胞，可以適當(dāng)延長觀察時間，中途可以換液保持細(xì)胞的良好狀態(tài)。如無熒光標(biāo)記可以通過Real-timePCR檢測目的基因的表達(dá)或通過WesternBlot檢測目的基因蛋白的表達(dá)情況來評估感染效率。8）以上的操作是針對貼壁細(xì)胞設(shè)計的。懸浮細(xì)胞的區(qū)別主要在細(xì)胞的分盤上，它不需要提前一天分盤。操作時直接將細(xì)胞離心后懸浮在不同的培養(yǎng)基中，計數(shù)分盤后，即可加入病毒。9）通過首次實驗和重復(fù)實驗，確認(rèn)目的細(xì)胞的感染方法和感染參數(shù)。正式試驗通過預(yù)實驗可以幫助確定使用重組Adenovirus顆粒感染目的細(xì)胞的優(yōu)化條件，如細(xì)胞接種密度，是否需要添加Polybrene，合適的MOI值等參數(shù)。正式實驗前，調(diào)整并保持細(xì)胞的良好狀態(tài)是非常重要的。有些細(xì)胞對Polybrene敏感，建議不要添加Polybrene去增強(qiáng)感染效率。14Adenovirus表達(dá)時間較長，但在一般代謝較旺盛的細(xì)胞（如293月HK21等）上，病毒感染24h后可以觀察到GFP熒光；代謝比較緩慢的細(xì)胞（如原代培養(yǎng)細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞等）GFP蛋白表達(dá)時間較長，感染后72-96h甚至更長時間才可以觀察到GFP熒光。感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察GFP的表達(dá)時間和表達(dá)強(qiáng)度來確定Adenovirus對目的細(xì)胞的感染情況。感染后期請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時換液和傳代，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。六、運輸和儲存對于長距離運輸，應(yīng)先將腺病毒載體保存在-80°C,再采用全程干冰運輸以防滴度下降。腺病毒載體在-80°C保存6個月，滴度不會明顯下降。建議保存6-12個月以上的樣品，進(jìn)行實驗前，重新測一次滴度。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融(小于3次)。使用前從-80°C取出病毒，室溫迅速融化，操作過程應(yīng)置于冰盒上進(jìn)行。用不完的病毒可以暫時放在-20°C冰箱中，但最好盡快用完。七、常見問題及解決方案Q:通常在轉(zhuǎn)移載體中最大能夠插入多大的目的基因序列？A：腺病毒作為優(yōu)秀的外源基因轉(zhuǎn)移載體，通常原則上插入的目的基因序列可達(dá)6-8kb。Q:Adenovirus對目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？A:一般，我們通過提高病毒稀釋度來提高病毒的轉(zhuǎn)染效率，必要時以在培養(yǎng)基中加入Polybrene(3-8yg/ml)來提高病毒的感染效率。同時，目的細(xì)胞良好的生長狀態(tài)是獲得正常感染效率的保證。3.Q:目的細(xì)胞可以被Adenovirus感染，但是GFP熒光強(qiáng)度很弱，為什么？A:目的細(xì)胞中GFP熒光輕度取決于病毒感染細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)、細(xì)胞類