新版細菌染色技術培訓課件

細菌染色方法細胞不染色而背景染色燃料與細胞結合而染色1新版細菌染色技術7/28/2023常用的染色方法革蘭染色：最經典常用；革蘭陽性、陰性菌；初步識別特殊形態(tài)抗酸染色：抗酸性、非抗酸性細菌；用于結核病、麻風病等熒光染色：敏感性強、效率高、易觀察；用于結核分枝桿菌等其它：鞭毛染色鞭毛有無、位置、數(shù)量；

異染顆粒染色白喉棒狀桿菌；莢膜染色2新版細菌染色技術7/28/2023常用燃料堿性染料

帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結合。常用的染料有堿性復紅、結晶紫、亞甲藍等。酸性染料:顯色離子帶負電荷，易與帶正電荷的被染物結合。通常用來染細胞質，而很少用于細菌的染色。常用的染料有伊紅、剛果紅等。復合染料（中性染料）：是堿性染料和酸性染料的復合物，如瑞氏染料（伊紅亞甲藍）、姬姆薩染料(伊紅天青)等；熒光染料：如熒光標記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。用于某些特殊的染色技術。脂溶性染料

如Sudanblack。3新版細菌染色技術7/28/2023染色方法的分類1.單染法:采用一種染料染色如用美蘭或稀釋石炭酸復紅等，使各種細菌均染成同一種單一的顏色。故此法只能顯示細菌的形態(tài)及大小，對細菌的鑒別價值不大。2.復染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進行先后染色，使不同種類的細菌、同種細菌的不同結構，分別染上不同的顏色，以便鑒別細菌。4新版細菌染色技術7/28/2023染色過程涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢5新版細菌染色技術7/28/2023細菌基本形態(tài)結構基本形態(tài)球菌桿菌弧菌特殊結構芽孢：枯草桿菌、破傷風梭菌莢膜：肺炎鏈球菌鞭毛：變形桿菌6新版細菌染色技術7/28/2023標本處理痰液：用無菌棉簽挑取干酪樣或膿性痰部分0.05-0.1ml，涂于載物玻片右2/3處，均勻涂抹成卵圓形痰膜（約2cm長),每張玻片只涂一份標本。

膿液：同痰涂片法。病灶組織或干酪塊等：先用組織研磨器磨碎后再行涂片。大小、厚度同痰涂片。體液標本：取標本10ml，3000rpm,離心30min，取沉渣涂片。大小、厚度同痰涂片。腦脊液：將腦脊液離心或甩片集菌后涂片備用。大便：取粘液便或者血便少量均勻涂布玻片，不可過厚。7新版細菌染色技術7/28/2023標本處理注意事項標本應以打圈的方式反復涂抹均勻，避免標本涂布不均影響結果判讀，或使染色不均造成陰陽不定。標本涂布不能過厚，影響染色效果。體液標本應濃縮集菌后取沉渣涂片。8新版細菌染色技術7/28/20239新版細菌染色技術7/28/2023普通染色法10新版細菌染色技術7/28/2023革蘭染色法（GramStain）是最常用的鑒別染色法之一。此染色法是由丹麥細菌學家ChristianGram氏于1882～1884年發(fā)明的，至今已逾百年，仍在廣泛使用，是細菌學中最為經典的染色方法。11新版細菌染色技術7/28/2023一、原理

細菌經結晶紫初染染成藍色。G+菌細胞壁肽聚糖層數(shù)多，且肽聚糖為空間網(wǎng)狀結構，再經乙醇脫水，網(wǎng)狀結構更為致密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為藍色。而G-菌細胞壁脂類含量多，肽聚糖層數(shù)少，且肽聚糖為平面片層結構，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，結合的染料復合物容易泄漏，細菌被脫色為無色，再經石炭酸復紅稀釋液復染成紅色。12新版細菌染色技術7/28/2023結晶紫初染碘液媒染乙醇脫色復紅復染涂片固定二、步驟標本處理13新版細菌染色技術7/28/2023

用于革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫(crystalviolet)。

媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和力或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落。

不同類型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精(ethanol)。

復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，常用的復染液是番紅。14新版細菌染色技術7/28/2023三、結果:

陽性菌——紫色陰性菌——紅色15新版細菌染色技術7/28/2023固定初染媒染脫色復染革蘭氏陽性菌，用符號“G+”或“GP”（Gram’sPositive）表示。

革蘭氏陰性菌，用符號“Gˉ”或“GN”（Gram’sNegative）表示。

16新版細菌染色技術7/28/2023四、影響因素1.操作：涂片的厚薄，不宜過厚染色時間的把握，尤其是脫色時間，脫色不宜過度固定過程不可用酒精燈直接加熱，避免過熱使菌體變性而影響染色效果。17新版細菌染色技術7/28/20232.染液

染液用完后應及時蓋上蓋子，以免揮發(fā)影響染色效果3.細菌因素

被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結果，如培養(yǎng)時間過長革蘭陽性菌可能染成陰性，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內。某些細菌存在染色困難、不易脫色等情況，可能會出現(xiàn)染色不均，陰陽不定的現(xiàn)象。18新版細菌染色技術7/28/2023五、臨床意義鑒別細菌：

用革蘭氏染色法可將所有細菌分為陽性與陰性兩類，可初步識別細菌，以利進一步鑒定。選擇藥物：

可根據(jù)革蘭氏染色性的不同，供臨床初步選擇用藥方向。與致病性相關：

大多數(shù)革蘭氏陽性菌的致病物質為外毒素，而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物質為內毒素。由此，可采取有針對性的治療方案。19新版細菌染色技術7/28/202320新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陽性葡萄球菌例子(金黃色葡萄球菌x1000)21新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陽性鏈球菌例子22新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陰性桿菌例子(大腸桿菌x1000)23新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陰性弧菌例子24新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陽性產芽孢桿菌例子25新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陽性短桿菌例子(李斯特菌x1000)26新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陰性彎曲菌例子27新版細菌染色技術7/28/2023革蘭氏陽性棒狀桿菌例子28新版細菌染色技術7/28/2023抗酸染色法

一、原理

結核菌、麻瘋桿菌、恥垢菌等抗酸性菌，因其菌體表面有一層類脂或脂質之皮膜不易著色，但一經著色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脫色。利用這特性并以增強的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以處理，使其脫色后再對比染色，此時抗酸性菌仍是固定著最初色素的顏色（紅色），也就易于鑒別。29新版細菌染色技術7/28/2023

涂片固定

酸性復紅初染

3%鹽酸酒精脫色

美藍復染

鏡檢標本處理二、步驟30新版細菌染色技術7/28/2023染色過程中的細菌顏色變化：抗酸桿菌非抗酸桿菌31新版細菌染色技術7/28/2023三、結果:

抗酸菌———紅色；

非抗酸菌——藍色。32新版細菌染色技術7/28/2023抗酸染色注意事項每張玻片只能涂一個標本，以免染色過程中因沖洗使菌體脫落，造成陰陽性結果混淆；注意生物安全，自我防護；脫色時間依據(jù)涂片厚薄適當調整，以無紅色為止。33新版細菌染色技術7/28/2023

抗酸染色的意義：用以鑒別抗酸菌（如結核桿菌和麻風桿菌）和非抗酸菌。34新版細菌染色技術7/28/2023熒光染色法一、原理

抗酸桿菌用熒光燃料AuramineO(金胺O)染色后，用含有紫外光源的熒光顯微鏡檢查，將會發(fā)出閃亮的橘黃色。這種方法可用較低倍鏡頭鏡檢，因此能快速找出抗酸桿菌。

35新版細菌染色技術7/28/2023二、步驟：

涂片固定

金胺O染色

鹽酸酒精脫色

復染

鏡檢涂布均勻，不可過厚時間可稍微延長，但不可少于規(guī)定時間脫色時間依片子厚薄適當調整復染時間不可過長熒光顯微鏡觀察有無黃綠色熒光標本處理36新版細菌染色技術7/28/2023三、結果:

陽性—明亮橘黃色熒光；陰性—無熒光

37新版細菌染色技術7/28/2023三、臨床應用：

熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。主要用于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。四、注意事項：

熒光染色法可以作為分枝桿菌的初篩實驗，初篩陽性的須做抗酸染色確認。38新版細菌染色技術7/28/2023特殊結構染色法39新版細菌染色技術7/28/2023細菌的某些基本結構如細胞壁、核質、胞漿顆粒和特殊結構如莢膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易著色，須用一些特殊染色法才能染上顏色。特殊染色法主要有莢膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、異染顆粒染色法等。這些染色法不僅能使特殊結構著色，還可使特殊結構染成與菌體不同的顏色，有利于觀察和區(qū)別。40新版細菌染色技術7/28/2023負染色法

所謂負染色法是指使背景著色而細菌本身不著色的一種染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如剛果紅或水溶性苯胺黑等進行染色。因酸性染料帶負電荷，而細菌本身在近乎中性的環(huán)境中也帶負電荷，同種電荷相排斥，故染色時菌體不著色，而只能使背景著色。實踐中常用墨汁負染色法配合單染色法（如美蘭染色法）檢查細菌的莢膜，使背景成黑色；菌體呈藍色；而莢膜不著色，從而使莢膜包繞在菌體周圍成為一層透明的空圈。41新版細菌染色技術7/28/2023墨汁染色法標本：腦脊液處理方法：離心或用細胞離心機離心濃縮染色方法：墨汁染色（負染色）結果：42新版細菌染色技術7/28/202343新版細菌染色技術7/28/202344新版細菌染色技術7/28/2023在細菌檢驗工作中，除異染顆粒染色法較常用外，由于其它特殊結構染色法操作費時，費用較高、染色過程要求非常嚴格，而普通染色法雖不能使特殊結構本身著色，但菌體著色后，莢膜和芽孢部分由于不著色也能顯示出來，再加上特殊染色法比較復雜，故日常工作中較少使用這些特殊結構染色法。45新版細菌染色技術7/28/202346新版細菌染色技術7/28/2023特殊染色鞭毛染色47新版細菌染色技術7/28/2023質量控制

每批或每天染色時應同步進行質控，質控方法如下：被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內。染色方法質控菌株陽性陰性革蘭染色SauATCC25923EcoATCC25922紫色紅色抗酸染色H37RVEcoATCC25922紅色藍色熒光染色H37RVEcoATCC25922橘黃色熒光無熒光48新版細菌染色技術7/28/2023常見細菌圖例肺炎鏈球菌49新版細菌染色技術7/28/2023無乳鏈球菌50新版細菌染色技術7/28/2023化膿鏈球菌51新版細菌染色技術7/28/2023缺陷乏養(yǎng)菌52新版細菌染色技術7/28/2023腦膜炎奈瑟氏菌53新版細菌染色技術7/28/2023淋病奈瑟菌54新版細菌染色技術7/28/2023產單核李斯特菌55新版細菌染色技術7/28/2023紅斑丹毒絲菌56新版細菌染色技術7/28/2023奴卡氏菌57新版細菌染色技術7/28/2023豚鼠/嗜水氣單胞58新版細菌染色技術7/28