免疫磁珠在ELISA中的應(yīng)用及方案設(shè)計(jì)課件

一、CEA介紹大腸癌組織可產(chǎn)生一種糖蛋白，作為抗原引起患者的免疫反應(yīng)。此種抗原稱為癌胚抗原（carcino-embryonicantigenCEA），可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。二、方案設(shè)計(jì)常規(guī)夾心法CEA抗體1-抗原-CEA抗體2-二抗（HRP標(biāo)記）本實(shí)驗(yàn)夾心法CEA抗體1-抗原-CEA抗體2（HRP標(biāo)記）該方案是直接法與夾心法的有效結(jié)合，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)。為目前市面上Elisa檢測(cè)試劑盒的通用發(fā)法。三、主要技術(shù)方法雙抗夾心法ElisaHRP標(biāo)記CEA單抗2Sephadex

G-25層析法1.

Elisa

A.實(shí)驗(yàn)步驟：1.抗原預(yù)包被。用包被緩沖液將抗原稀釋（濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），每孔加入200微升，37℃孵育1小時(shí)后，4℃放置16-18小時(shí)。2.洗滌。倒盡板孔中液體，加滿洗滌緩沖液，靜止3分鐘后倒掉。反復(fù)3次，最后一次盡量拍干板孔中剩余液體。3.加封閉緩沖液每孔200微升，37℃放置1小時(shí)。4.同2步洗滌。5.加被測(cè)血清100微升（做梯度稀釋），并作陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。37℃放置1小時(shí)或者4℃過(guò)夜。6.同2步洗滌。7.加二抗。50微升每孔加入適宜濃度的二抗，37攝氏度放置1小時(shí)。8.同2步一樣洗滌，并多重復(fù)一次，最后一次重復(fù)后一定要排干所有水分，否則會(huì)有假陽(yáng)性出現(xiàn)。9.顯色。每孔加入底物溶液100微升，室溫暗處放置10-15分鐘，然后用終止液終止顯色。10.酶標(biāo)儀讀數(shù)。B.需要配制的試劑1.包被緩沖液：0.05MpH9.6碳酸緩沖液，4℃保存Na2CO30.15gNaHCO30.293g稀釋至100ml2.洗滌緩沖液：0.01MpH7.4PBS-Tween-20，室溫保存NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9g或者Na2HPO41.15gTween-200.5ml(用前臨時(shí)加入)稀釋至1000ml3.封閉緩沖液：在洗滌緩沖液中加入5%脫脂奶粉或者10%BSA或者0.5%雞卵清蛋

白。（用時(shí)現(xiàn)配）4.稀釋緩沖液：在洗滌緩沖液中加入0.1%BSA。（用時(shí)現(xiàn)配）5.顯色終止液：2MH2SO4，室溫保存

蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸21.7ml，并邊加入邊混勻。6.底物緩沖液：pH5.0磷酸棗檸檬酸，4℃保存Na2HPO47.298g

檸檬酸4.669g加水至1000ml7.底物溶液：TMBS底物使用液（用時(shí)現(xiàn)配），450nm顯色TMBS（1mg/ml無(wú)水乙醇）1.0ml

底物緩沖液10ml1%H2O225微升

2.HRP標(biāo)記CEA單抗2

戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法Ⅰ.戊二醛二步法A.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共

價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。B.標(biāo)記步驟：

(1)稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)夜。

(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時(shí)。

(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。

(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。(7)

3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。C.需要配制的試劑：

(1)

0.1MPH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。

(2)

1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

(3)

1MPH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

(4)

0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸緩沖液1ml中。

(5)

0.15MPH7.4PBS及生理鹽水。

(6)

PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體（購(gòu)買）。

(9)

HRP(RZ>3.0)（購(gòu)買）。

D.優(yōu)缺點(diǎn)本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。Ⅱ.過(guò)碘酸鈉法A.原理：HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏堿，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。B.標(biāo)記步驟:

(1)稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

(3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜。

(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(抗體，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。

(5)加0.1ml新配的4mg／mlNaBH４液，混勻，再置4℃2小時(shí)。

(6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15MPH7.4PBS透析，4℃過(guò)夜。

(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。(7)

3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。C.需要配制的試劑(1)

0.1MNaIO４：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠)溶于蒸餾水10ml中。

(2)

1mMPH4.4醋酸鈉緩沖液:

0.2MNaAc(1.361克／50ml)3.7ml

0.2MHAc(0.601ml／50ml)6.3ml加蒸餾水至2,000ml。

(3)

0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液:

Na２CO３0.32克

NaHCO３0.586克加蒸餾水至50ml再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01MPH9.5的碳酸鹽緩沖液。

(4)

NaBH４溶液(4mg／ml):臨用時(shí)稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。

(5)其它的試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)記法。D.優(yōu)缺點(diǎn)本法所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和Ig結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重大損失，是目前最常用的方法。3.Sephadex

G-25層析A.分離原理

：當(dāng)混合樣液加到凝膠柱上，隨著洗脫劑而通過(guò)凝膠柱時(shí)，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動(dòng)，受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快，先出層析柱（此現(xiàn)象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）；而顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時(shí)不斷地從一個(gè)網(wǎng)眼穿到另一個(gè)網(wǎng)眼，逐層擴(kuò)散，阻滯作用大，流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，因而后出層析柱。在層析柱的出口處，我們用多個(gè)試管分步收集洗脫液，就可將混合物中各組分彼此分離。

當(dāng)我們從生物組織中用鹽析法提取蛋白質(zhì)后，常需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫鹽工作，我們可采用層析介質(zhì)為葡聚糖凝膠G-25，用適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)行洗脫，經(jīng)凝膠層析，就可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子鹽類分離。

B.試劑的配制

1.

葡聚糖凝膠Ｇ-25

溶脹凝膠方法：按每個(gè)層析柱約4g的量稱取葡聚糖凝膠G-25于燒杯中，加過(guò)量蒸餾水于沸水浴中溶脹2小時(shí)或在室溫下溶脹6小時(shí)以上。用傾瀉法除去上層漂浮的細(xì)碎凝膠，重復(fù)3～4次。操作中避免劇烈攪拌，防止破壞其交聯(lián)結(jié)構(gòu)。

2.

BaCl2溶液（1%）

3.

考馬斯亮藍(lán)G-250

稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。暗處存放。

4.

脲（6mol/L）

5.

洗脫劑

常規(guī)PBSC.操作步驟

1.

層析柱的準(zhǔn)備

(1)

清洗：每組取一支層析柱，用清水沖洗干凈。

（若玻璃柱較臟，應(yīng)卸去塑料裝置，先入洗液中浸泡2小時(shí)。）

(2)

安裝與檢查：檢查出口裝置中尼龍綢或燒結(jié)濾板是否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺(tái)架上。對(duì)準(zhǔn)出口處，放一只250mL燒杯。向?qū)游鲋鶅?nèi)灌洗脫劑，打開出口螺旋夾，檢查有無(wú)滲漏、出口乳膠管是否通暢等情況。

(3)

排氣泡：保持柱內(nèi)一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會(huì)從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內(nèi)，要想法排盡，否則會(huì)影響分離結(jié)果，排氣完畢，保留柱內(nèi)1～2cm高水位，關(guān)緊螺旋夾。

(4)

標(biāo)記高度：在距頂端8～10cm處做一標(biāo)記，作為衡量灌裝層析介質(zhì)床體高度（15～17cm）的依據(jù)。2.

裝柱

每組用50mL燒杯取溶脹的凝膠懸漿25～30mL，靜置片刻，觀察凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否則應(yīng)作調(diào)整。

輕輕攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，打開出水口，并不斷地向柱內(nèi)補(bǔ)充凝膠，直到凝膠沉淀高度位于標(biāo)記上方約2cm為止，凝膠柱內(nèi)若有氣泡和斷層或柱床表面干水和歪斜，都將影響分離效果。必要時(shí)，需倒出凝膠，重新裝柱。

3.

平衡

取15mL洗脫劑，用滴管沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著緩緩流下，不可沖動(dòng)膠平面，打開出水口，經(jīng)洗脫液的流動(dòng)，一方面清洗內(nèi)壁，另一方面使膠床收緊。洗脫平衡完畢，膠床上方保留約4cm高水位，關(guān)閉出水口。此時(shí)，膠床高度≥15cm為宜。

4.

準(zhǔn)備收集

取6只干凈的刻度試管（除凈試管內(nèi)殘留的水），1～6編號(hào)，并在試管2mL處作一標(biāo)記，插入試管架上，為收集洗脫樣品作好準(zhǔn)備。

5.

上樣與收集

打開出口排水，當(dāng)膠床與上方水層的彎月面相切時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將0.2mL混合樣液沿柱內(nèi)壁緩緩加入，勿沖動(dòng)膠面。上樣完畢，打開出水口，開始收集一號(hào)管。每管收集洗脫液2mL。

當(dāng)樣液進(jìn)入膠床，其彎月面與膠平面相切時(shí)，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著加入1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再緩緩注入3～5cm高的洗脫劑。

6.

洗脫

不斷向柱內(nèi)加洗脫劑，保持膠床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6號(hào)管達(dá)2mL時(shí)，關(guān)閉出口。

7.

鑒定

另取6只干凈試管，按收集順序?qū)⑾疵撘阂环譃槎?，即每?mL，依次在試管架上排成二排。

第一排每管加2滴BaCl2，根據(jù)白色沉淀多少，判斷SO42-在各管中的濃度。

第二排每管加1mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，根據(jù)藍(lán)色情況，判斷蛋白質(zhì)在各管中的濃度。將結(jié)果記錄于下表中。

若鑒定的第6號(hào)管中，仍有樣品，表明洗脫和收集不夠，需增加7號(hào)、8號(hào)……試管繼續(xù)洗脫與收集，同上法鑒定其蛋白質(zhì)和鹽濃度情況。

管

號(hào)

項(xiàng)

目

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

白色沉淀量

藍(lán)色深淺

8.

再生

鑒定完畢，打開出水口，繼續(xù)用２～３倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關(guān)閉出口，以備下次使用。

四、實(shí)驗(yàn)所需購(gòu)買材料、試劑材料、試劑訂購(gòu)公司價(jià)格預(yù)計(jì)使用量賴氨酸金泰公司（長(zhǎng)春）124元/100g100gHRP（辣根過(guò)氧化物酶）金泰公司（長(zhǎng)春）250元/100mg20mgCEA抗原（L1C00207）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢（1mg/mL）1mgCEAIgG1（單抗貨號(hào)L1C00205）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢1mgCEAIgG1（多抗貨號(hào)L1C00202）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢5mgNaIO４金泰公司（長(zhǎng)春）80元/100g500mgNaBH４金泰公司（長(zhǎng)春）90元/100g500mgSephadexG-25層析柱(2cm×50cm/1cm×25cm)杭州三特醫(yī)藥化工有限公司450元-650元/個(gè)1個(gè)SephadexG-25鄭州勤實(shí)科技有限公司300元/25g5g13.7.21日過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記HRP于鼠單抗標(biāo)記結(jié)束，結(jié)果如下：利用BioTec多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)記物的OD280nm及OD403nmOD280nm=0.674OD403nm=0.438IgG量（mg/ml）=（OD280nm-OD403nm*0.3）*0.62=0.336412酶量（mg/ml）=OD403nm*0.4=0.1752克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量=2.08315即2.08315個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上。酶結(jié)合率=酶量*體積/抗體=52.08%標(biāo)記率＞0.6經(jīng)過(guò)多次ELISA驗(yàn)證HRP標(biāo)記成功的單抗的可用性0.2780.2321.7691.9381.4681.4891.0041.1110.4010.3361：500稀釋包被抗原0.2680.2211.6691.8381.3681.3320.9860.9420.3010.3361：2000稀釋包被抗原0.2790.2431.65517711.2641.4750.7650.8050.2890.2951：4000稀釋包被抗原陰性對(duì)照原濃度單抗1:50稀釋單抗1:100稀釋單抗1:200稀釋單抗HRP標(biāo)記單抗效價(jià)測(cè)定（間接法）：抗原（包被）+HRP標(biāo)記的鼠單抗+TMB及終止液顯色由以上數(shù)據(jù)可看出，HRP標(biāo)記的單抗效價(jià)為最高1:100，但由于ELISA陽(yáng)性值在1以上（同時(shí)不能過(guò)大）為最佳選擇，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇1:50稀釋酶標(biāo)單抗，這個(gè)效價(jià)為HRP標(biāo)記前的單抗效價(jià)的50%，即本方法標(biāo)記單抗導(dǎo)致單抗效價(jià)降低50%。使用HRP酶標(biāo)單抗構(gòu)建測(cè)定抗原（羊肚菌菌絲）含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線抗原捕獲量測(cè)定（雙抗夾心法）：兔多抗包被+梯度濃度抗原+HPR標(biāo)記鼠單抗+TMB及終止液顯色抗原濃度（ng/ml)025.0450.0875.12100.16125.20150.24175.28200.32平行對(duì)照(OD450nm)0.2160.4320.6890.8761.0021.1891.3511.5061.5240.2310.4250.7010.8431.0241.2041.3871.5231.517平均值0.2240.4290.6950.8601.0131.1971.3691.5151.521免疫磁珠在ELISA中的應(yīng)用及方案設(shè)計(jì)

匯報(bào)人閆斯楠日期2013.9.1目錄1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介2.免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)3.免疫磁珠與ELISA聯(lián)用的方案設(shè)計(jì)1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)

免疫磁珠（IMB），也稱免疫磁性微球，是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上有載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料，最外層是免疫配基。免疫磁性微球結(jié)構(gòu)免疫磁珠載體微球載體微球磁性物質(zhì)高分子層功能基金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白和牛血清白蛋白等如氨基、羧基、羥基，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)免疫配基免疫配基通過(guò)生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同，從而可結(jié)合不同的免疫配基，如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)，而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性，保證磁珠的特殊識(shí)別功能。1.2免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性，從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的新復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一致磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的特異性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)，從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除，磁珠分散，由此可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)1.3免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠（IMB）技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為