分子生物學技術

分子生物學技術第1頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、分子生物學概念

（一）基本概念

（二）基因的堿基順序與蛋白質的氨基酸順序

（三）基因的結構

（四）基因的表達與調(diào)控

第2頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

（一）基本概念

基因：是編碼蛋白質或RNA分子遺傳信息的基本遺傳單位。從化學角度觀察，基因則是一段具有特定功能和結構的連續(xù)的脫氧核糖核酸序列，是構成巨大遺傳單位染色體的重要組成部分。

順反子：順反子和基因這兩個術語是互相通用的。一般來說，一個順反子既是一個基因，大約含有1500個核苷酸對，是由一群突變單位和重組單位組成的線性結構。第3頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月因此，順反子概念表明：基因不是最小單位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸區(qū)段才是基因的編碼區(qū)。

每一個順反子就是一段核苷酸序列，或者是一個基因的DNA或RNA單元，它編碼一種完整的多肽鏈。順反子是功能單位，它是由許多可以突變的位點組成的，而這些位點之間又可以發(fā)生交換。

多體蛋白質（multimericproteins）：由數(shù)個亞基組成的蛋白質。第4頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月同型多體蛋白質：在多體蛋白質中，如果所有的亞基都是同樣的，這種蛋白質就屬于同型多體（homomultimer）蛋白質，由一種基因編碼。

異型多體（heteromultimer）蛋白質：亞基各不相同的蛋白質，由多種基因編碼。如血紅蛋白。

第5頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）基因的堿基順序與蛋白質的氨基酸順序

1.

中心法則（centraldogma）：既遺傳信息是從DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白質

而遺傳信息從DNA直接到蛋白質的傳遞，只是一種理論上的可能性，迄今尚未得到證實。

第6頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2.密碼子：每3個堿基編碼一種氨基酸，就會編碼出64種（43=64）不同的氨基酸。蛋白質分子是由20種不同的氨基酸構成的，因此，1種氨基酸可有幾個不同的密碼子，既3個堿基甚至更多的堿基編碼一種氨基酸是必要的。

遺傳密碼是否重疊？研究證實：遺傳密碼是不重疊的。

三聯(lián)體之間是否存在著“逗號”？研究證實：堿基的閱讀是從一個固定的起點按序進行的，不存在有什么“逗號”的問題。

…QABCQDEFQGHIQJKLQ…第7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）基因的結構

基因的編碼區(qū)（即轉錄區(qū)）是連續(xù)不斷的序列，包括一個起始密碼子ATG和一個終止密碼子TAA。編碼區(qū)的兩側是轉錄而不轉譯的側翼序列區(qū)，其中5`非轉譯區(qū)簡稱5`UTR，含有一個核糖體結合位點及一個轉錄起始信號；3`非轉譯區(qū)簡稱3`UTR含有一個轉錄終止信號。

無論是真核的基因還是原核的基因，都可劃分成編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個基本組成部分。

編碼區(qū)含有大量的可以被細胞質中轉譯機器閱讀的遺傳密碼，包括起始密碼子（通第8頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月常是AUG）和終止密碼子（UAA，UAG或UGA）。非編碼區(qū)結構中的5`末端非轉譯區(qū)（5`UTR）和3`末端非轉譯區(qū)（3`UTR），對于基因遺傳信息的表述是必要的，但它們都不會被轉譯成多肽序列。

真核基因與原核基因的區(qū)別：

事實上，真核生物的基因都是以單順反子的形式存在，因此它們編碼的也都是單基因產(chǎn)物。而大腸桿菌類原核生物往往是多順反子，它轉錄的是一種大分子量的mRNA，可同時編碼兩種甚至數(shù)種的基因產(chǎn)物。第9頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）基因的表達與調(diào)控

結構基因(structuralgene)：編碼細胞成份，如代謝酶類、轉運蛋白質和細胞骨架成份等的基因。

調(diào)節(jié)基因（regulatorygene)：編碼控制其他基因表達的RNA或蛋白質產(chǎn)物的基因。

操縱基因（operator):指接受來自調(diào)節(jié)基因合成的調(diào)節(jié)蛋白的作用，使結構基因轉錄活性得以抑制的特定的DNA區(qū)段，也稱為控制單元。第10頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月儲藏在基因中的遺傳信息分轉錄和轉譯兩步進行表達，這種遺傳信息從DNA到RNA再到蛋白質的流向，在所有的細胞類型中都是受到高度調(diào)節(jié)的，同時在有些情況下也是嚴格協(xié)同的?；虮磉_的此種嚴格調(diào)控機理，保證細胞不會浪費能量用于合成它所不需要的基因產(chǎn)物。

從基因研究上，操縱子概念比順反子又進了一步。即基因不但在結構上是可分的，而且在功能上也是有分工的。同時，有的基因控制蛋白質產(chǎn)物的合成，而有的基因并沒有直接的產(chǎn)物。操縱子模型第11頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月二、核酸探測技術

（一）指紋圖譜

（二）核酸分子雜交第12頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）、指紋圖譜

指紋圖譜：即核酸酶切圖譜，對生物的蛋白質、DNA和RNA進行分析的電泳圖、雜交放射性自顯影圖等。在微生物研究上，主要是用限制性內(nèi)切酶（ERA）對病毒、細菌DNA進行酶切分析的圖譜。

原理：在微生物（細菌）細胞中有1種限制性內(nèi)切酶類（II，稱為RE），能特異性的識別和切割DNA鏈上特定的一段DNA片段，這類酶廣泛應用于基因工程的各個方面。

ERA就是用RE消化病毒或細菌的DNA或質粒，將消化物于瓊脂凝膠中電泳分離，經(jīng)第13頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠（EB）染色，然后分析DNA酶切片段的數(shù)目、遷移率等分析微生物的變異現(xiàn)象、鑒定毒株、分型及了解基因結構和進行流行病學研究等等。

方法：

1.DNA抽提

2.DNA酶切

3.電泳

4.染色

5.觀察、照相

6.分析

7.酶切圖譜

第14頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針技術

前言

(一)核酸探針的種類

(二)核酸探針的制備

(三)核酸雜交

(四)核酸探針技術在動物檢疫中的應用第15頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月前言

化學及生物學意義上的探針(probe)，是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。

核酸探針技術原理是堿基配對?；パa的兩條核酸單鏈通過退火形成雙鏈，這一過程稱為核酸雜交。（基本過程是：加熱變性第16頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月降溫復性。）核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。每一種病原體都具有獨特的核酸片段，通過分離和標記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。

第17頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)核酸探針的種類

1.按來源及性質劃分可將核酸探針分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。

作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應用最為廣泛，它的制備可通過酶切或聚合酶鏈反應(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質粒或噬菌體載體中，隨著質粒的復制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。第18頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月將RNA進行反轉錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測。cDNA探針序列也可克隆到質?；蚴删w中，以便大量制備。將信息RNA(mRNA)標記也可作為核酸分子雜交的探針。但由于來源極不方便，且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應用較少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應用十分廣泛，可根據(jù)需要隨心所欲合成相應的序列，可合成僅有幾十個bp的探針序列，對于檢測點突變和小段第19頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月堿基的缺失或插入尤為適用2.按標記物劃分有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應用最廣泛的探針標記物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應用最普遍。放射性標記的優(yōu)點是靈敏度高，可以檢測到Pg級；缺點是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高等。因此，放射性標記的探針不能實現(xiàn)商品化。目前，許多實驗室都致力于發(fā)展非放射性標記的探針。第20頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月目前應用較多的非放射性標記物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素，對親和素有獨特的親和力，兩者能形成穩(wěn)定的復合物，通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(如酶、熒光素等)進行檢測。地高辛是一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進行免疫檢測，原理類似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當，而特異性優(yōu)于生物素標記，其應用日趨廣泛。第21頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸探針的制備

1.DNA探針制備

（1）以病原細胞核或病毒中提取的特異性DNA，用理化學方法將其純化，然后再用限制性核酸酶將DNA切割成若干片段，電泳回收目的DNA；

（2）酶促反應合成法，即從病原中提取mRNA，在反轉錄酶作用下合成互補結構的DNA（cDNA）；

（3）化學合成法，以單核苷酸為原料，人工合成DNA的某一片段。第22頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2.RNA探針

全基因RNA探針可用RNA病毒的基因標記即可；由DNA轉錄出探針RNA，可由RNA聚合酶獲得大量高純度的RNA，其靈敏度比DNA探針高出10多倍。

第23頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)核酸雜交

雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡稱NC膜)或尼龍膜(nylonmembrane)。固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物上；第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測。第24頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交并進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。某特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內(nèi)。例如?？捎锰禺愋缘募毦?、病毒的核酸做為探針對組織、細胞進行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。第25頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月近年來液相雜交技術有所發(fā)展。液相雜交與固相雜交的主要區(qū)別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。液相雜交步驟有所簡化，雜交速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。

各種雜交技術中，膜上印跡雜交技術應用最為廣泛，它由以下三個基本過程組成。1.核酸印跡技術

(1)斑點印跡(Dot-blot)將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。第26頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月為使核酸牢固結合在膜上，通常還將點樣后的膜進行80℃真空烘烤2h。

應用斑點印跡技術，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應用較廣。適合進行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測基因的分子量。(2)Southern印跡(Southernblot)這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉移到固相支持物上的過程。常規(guī)處理如下，先用限制性內(nèi)切酶對DNA樣品進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將第27頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉移到NC膜或其它固相支持物上，轉移后各DNA片段的相對位置保持不變。用探針與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可鑒定待測DNA的大小、進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)等。

(3)Northern印跡(Northernblot)Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上的過程。RNA樣品經(jīng)第28頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡后進行雜交反應可鑒定其中特異mRNA分子的量與大小。

Northern印跡的方法與Southern印跡基本相同，可參照進行。但RNA的變性方法與DNA不同。DNA樣品可先通過凝膠電泳進行分離，再用堿處理凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性,因為堿會導致RNA水解。因此，在Northern印跡前，須進行RNA變性電泳，在電泳過程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進行印跡轉移。RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛-二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理第29頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過程中變性而完全解離形成單鏈。2.雜交反應的基本過程雜交反應包括預雜交、雜交和漂洗幾步操作。

預雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測核酸分子中的非特異性位點封閉，以避免這些位點與探針的非特異性結合。雜交反應是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫第30頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月度和條件下進行復性反應的過程。雜交反應結束后，應進行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后,將繼續(xù)進行雜交信號的檢測。第31頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)核酸探針技術在動物檢疫中的應用

核酸探針技術是目前分子生物學中應用最廣泛的技術之一，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的有力工具。核酸探針可用以檢測任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關的毒(菌)株和寄生蟲。目前，各種常見病毒病的診斷和研究都已應用到核酸探針技術，這方面的研究報道數(shù)以萬計且與日俱增。但該項技術的操作畢竟比常規(guī)方法復雜，費用較高，在動物檢疫中尚未推廣。多在實驗室內(nèi)對病原作深入研究時使用。第32頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月三、聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction，PCR)由美國Centus公司的KaryMullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報道，是近年來開發(fā)的體外快速擴增DNA的技術。通過PCR可以簡便、快速地從微量生物材料中以體外擴增的方式獲得大量特定的核酸，并且有很高的靈敏度和特異性，可在動物檢疫中用于微量樣品的檢測。

1.PCR的基本原理和過程PCR技術是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的第33頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月條件下依賴于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應。PCR以欲擴增的DNA做為模板，以和模板正鏈和負鏈末端互補的兩種寡聚核苷酸做為引物，經(jīng)過模板DNA變性、模板引物復性結合、并在DNA聚合酶作用下發(fā)生引物鏈延伸反應來合成新的模板DNA。模板DNA變性、引物結合(退火)、引物延伸合成DNA這三步構成一個PCR循環(huán)。每一循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又成為下一個循環(huán)的模板DNA。這樣，目的的DNA的數(shù)量將以2n-2n的形式累積，在2小時內(nèi)可擴增30(n)個循環(huán)，DNA量達原來的上百萬倍。第34頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR三步反應中，變性反應在高溫中進行，目的是通過加熱使DNA雙鏈解離形成單鏈；第二步反應又稱退火反應，在較低溫度中進行，它使引物與模板上互補的序列形成雜交鏈而結合上模板；第三步為延伸反應，是在4種dNTP底物和Mg2+

存在的條件下，由DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈的延伸反應。通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩個引物之間的片段不斷得到擴增。對擴增產(chǎn)物可通過凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進行檢測。PCR擴增示意圖第35頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月4.PCR衍生技術PCR可擴增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進行反轉錄PCR以擴增cDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術。除反轉錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補PCR、免疫PCR和套式PCR等。

(1)反轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT－PCR)

RT－PCR用于擴增RNA樣品。在PCR體系中先引入反轉錄酶，將RNA反轉錄獲得cDNA，再以cDNA做為PCR的模板，加入引物和TaqDNA聚合酶按正常第36頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR方式擴增cDNA。這一技術廣泛應用于RNA和RNA病毒的檢測。

(2)錨定PCR(AnchoredPCR)通常進行的PCR試驗必須知道欲擴增DNA或RNA片段兩側的序列，并以此為依據(jù)設計引物進行PCR。當欲擴增的片段序列未知時，可通過錨定PCR進行擴增。其基本方法是分離細胞總RNA或mRNA并經(jīng)反轉錄合成cDNA，通過DNA末端轉移酶在cDNA3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通過與其互補的錨定引物poly(dC)來保證擴增反應的特異性。第37頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)反向PCR(InversePCR)常規(guī)PCR是擴增兩個已知序列之間的DNA片段，反向PCR則用于擴增位于已知序列兩側的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段環(huán)化，再用限制性內(nèi)切酶切開已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī)PCR操作就可大量擴增未知序列。

第38頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)不對稱PCR(AsymmetricPCR)不對稱PCR又稱單鏈擴增PCR。一般PCR反應中兩種引物的量是相等的，不對稱PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為50:1-100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會被用完，大量生成一條單鏈的DNA，分離單