ISHprotocol熒光原位雜交關(guān)鍵技術(shù)實驗專項方案

ISH，冰凍切片操作過程：1、 多甲固定：應(yīng)盡量在半個小時內(nèi)完畢?！补潭ㄆ陂g以24-36小時為宜，避開RNA降解或固定過度?！?、 凍切片應(yīng)切成10um-20um。〔選用16um〕〔切好片子可以保存在-70度中〕但是要留意，保存在-70度中切片，拿出來后來，準時在4%多甲中重固定，避開在重固定前切片恢復(fù)室溫?！仓毓潭?0-15min〕3、 用0.1MPB洗切片3*5min4、 片放入100%乙醇5min，空氣中枯燥。雜交液：〔20ml〕 藏于-20度20*SSC 4ml4g去離子甲酰胺10ml解后，參加如下物質(zhì)：PolyA〔10mg/ml〕0.5mlSsDNA〔10mg/ml〕0.5mltRNA 〔10mg/ml〕0.5mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配備后長期貯藏與-20度中，用前預(yù)熱到37度。〔100ng-1000ng/ml，一般200ng/ml為起點來摸索條件〕，所加雜交液體積看切片大小來打算，對于2cm*2cm50ul30-40ul足夠?！擦粢庵虚g不要留有任何氣泡〕，為防止雜交液，〔枯燥話雜交會有一種很高背景〕在濕盒中37度雜交18小時，這個雜交時間可以延長到40小時來提高雜交信號，但是前提是不能讓切片枯燥。;1*SSC〔20*來稀釋〕SSC55度。1*SSC10mMDTT〔1.2gDTT800mlSSC中〕快洗：1*SSC〔10mMDTT〕室溫度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT)55度1*10min 0.5*SSC〔10mMDTT〕室溫將切片始終放在最終一步溶液中始終到下一步操作。檢測：〔100mMtris-HCl，150mMNaCl，PH=7.5〕，將切片在TBS3*5min，封閉：〔可選〕30min〔封閉液配方:TBS+0.1%tritonX-100+1%正常綿羊血清1%其他適當(dāng)封閉劑〔Roche〕〕,TBS+0.1%tritonX-100+1%正常綿羊血1%其他適當(dāng)封閉劑〔Roche〕4小時，然后在TBS3*5min，然后在去離子水洗滌幾次以去除鹽，最終用抗淬滅劑分片觀測原位雜交要做比照;1、 切片中mRNA質(zhì)量〔前提是穎組織樣品〕和protocol有效性。RNA已經(jīng)降解比較嚴峻。2、RNARNARNA〔留意，RNAPBS*5min〕以說明雜交信號是特異性雜交預(yù)解決：1、 恒溫箱內(nèi)枯燥切片后，滴加5-10μg/ml蛋白酶K，置37℃濕盒內(nèi)孵育30min4℃755minK活性。K1μg/ml(0.1mol/LTris,50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中)，3715~20min，以到達充分KDNA蛋白質(zhì)作用，從而提高雜交信號。甘K0.1mol/L甘氨酸溶液(在PBS中)K消化作用，應(yīng)用胃蛋白酶(Pepsin)20~100μg/ml(0.1NHCl配)37℃、30min進展消化，所獲試驗成果優(yōu)于蛋白酶K。為保持組織構(gòu)造，4%多聚甲醛再固定。2、0.25%10min702×SSC漂洗、402×SSC15min，2×SSC3min75-100%酒精梯度脫水。蛋白酶K能消化和暴露被遮擋靶核酸，以增長探針可結(jié)合性。蛋白酶K濃度過低，不能使靶核酸有效暴露，濃度過高則組織消化過度，也會影響檢測成果。蛋白酶K須用蛋白酶K緩沖液配制(0.1mol/LTris-HClPH8.0，50mmol/LEDTA，經(jīng)高壓滅菌后備用)，蛋白酶K內(nèi)分裝保存。蛋白酶K消化組織切片是原位雜交試驗流程中重要環(huán)節(jié)，蛋白酶K濃度應(yīng)力求準確無誤。依照組織類型、固定液種類，固定期間和切片厚薄不同，蛋白酶K濃度也存在差異，選用蛋白酶K最正確消化濃度是原位雜交成功必要條件，不行省略預(yù)雜交;臨用前加；△預(yù)雜交液不加SSC50℃促溶，依次參加其他成分。硫酸葡聚糖在室溫常需數(shù)小時才能完全溶解。有時需旋渦振蕩。定容后充分混合。依照使用以便可分裝〔最正確用鋁箔將瓶子包好〕存于4℃，可達數(shù)月。留意，雜交緩沖液在使用前切忌污染1、 將DEPC解決切片經(jīng)ddH2O漂洗2×5min2、 按組織片大小，每張切片滴加40μl雜交液，置37℃溫盒內(nèi)2小時雜交1、 魔筆沿組織周邊劃圈，滴加30μl探針雜交液/每張切片(內(nèi)含20ng地高辛標(biāo)記探針)，在某溫度下〔改溫度為：TM-〕濕盒內(nèi)孵育過夜雜交液內(nèi)參加變性剪切鮭魚精子DNA在雜交前參加，與其他雜交液分開儲存。雜交后解決137℃2×SSC2×10min。2.在37℃2×SSC漂洗2×15min、1×SSC漂洗2×15min、0.25×SSC漂洗2×15min，均需用振蕩漂洗切片。最適復(fù)性溫度〔Optimunmrenaturationtemperature，TOR〕：Tor=Tm–25℃苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm–(3035℃)2×SSC反映液中，可以依照以下公式計算最適復(fù)性溫度：TOr=0.51(G+C%)+47℃減低背景染色背景染色形成是諸多因素構(gòu)成。雜交后(Posthybridization)酶解決和雜交后洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(aceticanhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以減低靜電效應(yīng)，削減探針對組織非特異性背景染色。在雜交后漂洗中RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。一般遵循共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必要留意是漂洗過程中，切勿使切片枯燥?？菰锴衅m然大量溶液漂洗也很難削減非特異性結(jié)合，從而增加了背景染色。4 雜交后漂洗(1)2×SSC液內(nèi)振動移除蓋片。(2)2×SSC55℃10min×2。(3)0 5×SSC50℃5min×2。緩沖液Ⅱ(含0 5%封阻試劑，用緩沖液Ⅰ溶解)37℃30min。緩沖液Ⅰ(100mmol/LTris HCl,15 0mmol/LNaClpH7 5)15min,室溫。酶標(biāo)地高辛抗體(1∶5000，應(yīng)用緩沖液Ⅰ解釋)37℃30min。(7)15min×2，室溫。(8)緩沖液Ⅲ(100mmol/LTris HCl,100mmol/LNaCl,50mmol/LMgCl 2,pH9 5)室溫，min。(2)雜交后漂洗其目是去除未參與雜交體形成過剩探針,消退與組織或細胞之間非特異性結(jié)合探針,削減背景染色,增長信/噪比。2×SSC將蓋玻片洗脫,2×SSC30215min;1×SSC42215min;0過程中切不要使切片枯燥。(5)比照試驗

5×SSC37215min,TBS2①陽性比照:用含靶核酸序列組織作比照。②陰性比照:用不含待測靶核酸序列組織作比照。③用免疫組化檢測方法來擬定雜交信號分布。④省略標(biāo)記探針。⑤DNA酶消化靶DNA〖HJ1〗(6)非特異性染色非特異性染色或許會來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細胞、顯色系統(tǒng)等;探針特異性不高以及組織細胞內(nèi)某些成分與顯示系統(tǒng)中抗體成分非特異結(jié)合也可導(dǎo)致非特異性染色。組織細胞內(nèi)源性酶是原位雜交中非特異性著色重要因素,當(dāng)前最慣用酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細胞中,因而用這些酶時應(yīng)有消退內(nèi)源性酶相應(yīng)環(huán)節(jié)。如過氧化物酶用3%H 2O 2解決5~10min;10%冰醋酸解決組切片10min,或在底物顯色液中參加1mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶染色。NBT/BCIP顯示堿性磷酸酶時假設(shè)在光照下顯色也會增加非特異性染色。必要依照檢測系統(tǒng)不同標(biāo)記酶作不同內(nèi)源酶解決。探針長度原位雜交反映中探針濃度應(yīng)超過靶序列濃度，探針濃度必要予以該試驗最大信噪比，由于背景著色度凹凸與探針濃度關(guān)于。最正確探針濃度是最低探針濃度到達靶核酸最大飽和結(jié)合度為目。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標(biāo)記cRNA0.5ng/μl，而非cRNA1.0ng/μl30-50μl流失核心是，載玻片清潔解決必要徹底，應(yīng)用雜交罩等也很必要。雜交溫度和時間設(shè)立和調(diào)整雜交溫度是RNA原位雜交重要環(huán)節(jié)。雜交溫度應(yīng)低于解鏈或融解溫度(meltingtemperatureTm)20-30℃。多數(shù)RNA原位雜交Tm為95℃，由于這一溫度對保存組織形態(tài)完整和組織切片粘附將產(chǎn)生不利影響，為此在雜交液中常以增長甲酰胺濃度來削減Tm值，由于每增長1％甲酰0.72℃。此外雜交體中GCNa+濃度也與Tm交反映時間可隨探針濃度增長而縮短，雜交時間過短會導(dǎo)致雜交不完全，雜交時間過長會增長非特異性著色。一般RNA原位雜交承受雜交孵育過夜，在黑暗環(huán)境下進展，可以避免光線對甲酰胺電離作用。為利于mRNA36小時，以免引起RNA(三)預(yù)雜交(1)切片用DEPC解決PBSPH7.4(140mmol/LNaCl，2.7mmolKCl,10mmol/LNa2HPO4，1.8mmol/LKH2PO4)孵育2×5min，再用DEPC解決含100mmol/L苷氨酸(Glycine)PBS孵育切片2×5min。(2DEPC0.3%TritonX-100PBS15min。(3DEPCPBS2×5min。(4)TE〔100mmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH8.0〕RNA1μg/mlK，3730min。石蠟切片用TERNA5-20μg/ml蛋白酶K，在37℃30min。(54℃下用DEPC4PBS5min。(6)再用DEPC解決PBS沖洗切片2×5min。(7)切片作酸酐解決，解決液含0.250.1mol/L三乙醇胺(TriethanolamineTEA)PH8.0，振蕩漂洗2×5min。(8)在37℃孵育切片后，雜交緩沖液沖洗〔含50％去離子甲酰胺4×SS，至少10mi。留意事項切片通透化是RNA原位雜交核心環(huán)節(jié)，特別對回憶性資料尤為重要，因固定液種類和固定期間不同，需作最正確通透化條件摸索，涉及蛋白酶K20-30min0.2mol/LHCL0.1％胃蛋白酶。由于醋酸酐極不穩(wěn)定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。(3)1×SSC=150mmol/LNaCl,15mmol/LsodiumcitratepH7.2。(四)免疫熒光檢測滴加封閉緩沖液(100mmol/LTris-HClPH7.5、150mmol/LNaCl、2%BSA)37℃濕盒30min，以封閉非特異性結(jié)合部位。瀝干細胞片，滴加抗地高辛抗體(1:200、1:5003745min。用BufferAPH7.5(100mmol/LTris-HCl、150mmol/LNaCl、0.05%Tween20)沖洗漂洗5min。由低濃度至高濃度(70%，90%，100%)各級酒精梯度脫水各5min?？諝庵锌菰锛毎?。滴加甘油顯色混合液。留意事項甘油顯色混合液配制：91(1mol/LTris-HCl(PH7.5)，2%1.4-diaza-bicyclo-[2.2.2]-octane(DABCODNAPropidiumiodidePI500ng/ml)或DAPI(75ng/ml)在熒光顯微鏡下觀測。預(yù)雜交和雜交30μl1h。如加鯡魚精子DNA,用前須在沸水浴中10min,酵母tRNA預(yù)雜交后以2×SSC漂洗,以吸水紙試干切片周邊水份,應(yīng)用預(yù)雜交液稀釋地高辛標(biāo)記Oligo 探針,濃度依照于待測核苷酸含量和實踐成果。如對于檢測大鼠垂體前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNAOligo342ng/μl)。

342ng/ml(030μl373642℃。2×SSC1h。(5)1×SSC1h(室溫)。(6)0(7)0

5×SSC37℃漂洗半小時。5×SSC(8)顯示等方法同前述。Application

Conc.[g/_l]

Sufficientfor...insituhybridization

1:500–1:1000

0:2–0:42．Denhardt’液一般配成10×，50×或100×儲藏液800ml左右滅菌ddH2O1000ml后，過濾后于-20℃保存?zhèn)溆?。該液用于配制雜交液及予雜交液等。蛋白酶〔ProteinaweK，Pro.K〕K重要用于雜交前標(biāo)本解決，其作用是使組織到達肯定消化，利于檢測分子穿透，從而提高檢測方法敏感性，但各種組織在不同條件下消化限度不一，因而，具體應(yīng)用時，應(yīng)依照組織種類、溫度擬定反映時間及酶濃度。過度消化可使組織形態(tài)構(gòu)造遭到明顯破壞，核酸分子也會受到影響。一般是將其配成儲藏液〔1mg/ml〕，臨用前，再配成工作液〔0.025mg/ml〕。配制方法：細心稱藥，將兩者充分混合后，分裝成小份，-20℃存儲，用時再取出凍融，余者棄去?！?〕工作液〔臨用前配〕：取儲藏液〔1mg/ml〕1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K25mg/ml工作液?！?〕P-K緩沖液配制：稱取上述試劑，充分混合即可。②1mol/LTris-HCl(pH8.0)：Tris800mlddH2OHClpH8.0,ddH2O1000ml，高壓滅菌，室溫備用即可。③0.5mol/LEDTA：EDTA600mlddH2O60℃持續(xù)攪拌以